細(xì)胞周期素D1基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制的研究.pdf

1、細(xì)胞周期素D1，是細(xì)胞周期G1期的關(guān)鍵蛋白，它感應(yīng)細(xì)胞外界刺激，在細(xì)胞從G1期轉(zhuǎn)變到S期的過(guò)程中起重要作用。細(xì)胞周期素D1與CDK4／6形成激酶復(fù)合物，這個(gè)激酶復(fù)合物磷酸化Rb蛋白，釋放出E2F從而促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)入S期。細(xì)胞周期素D1基因在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)。由于細(xì)胞周期素D1是一個(gè)細(xì)胞周期關(guān)鍵基因，因此它被認(rèn)為是腫瘤的治療和檢測(cè)的標(biāo)志基因之一，它的調(diào)控機(jī)理也一直是研究的熱點(diǎn)。熱療也是腫瘤治療的方法之一。熱休克條件下的基因表達(dá)調(diào)控以熱休克

2、蛋白如HSP90等的調(diào)控機(jī)制研究的最為深入，而其他基因在熱休克條件下的表達(dá)調(diào)控機(jī)制還不是很清楚。本研究探討的是細(xì)胞周期素D1基因在熱休克條件下的表達(dá)調(diào)控機(jī)制，它不但在基礎(chǔ)理論上同時(shí)在實(shí)際應(yīng)用中也有著一定的意義。 1．報(bào)告基因活性分析結(jié)果顯示細(xì)胞周期素D1基因啟動(dòng)子-39～-30位的NF-κB 位點(diǎn)是熱休克的應(yīng)答元件。 1．1刪切和突變的細(xì)胞周期素D1基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的能模擬染色質(zhì)狀態(tài)的pREP4-m-CAT報(bào)告基因表達(dá)質(zhì)粒

3、的構(gòu)建。“全長(zhǎng)”的細(xì)胞周期素D1基因啟動(dòng)子報(bào)告基因質(zhì)粒(pREP4-m-1745CD1-CAT)，選取酶切位點(diǎn)從5’端刪切構(gòu)建一系列5’刪切質(zhì)粒。應(yīng)用Asp718／AfI Ⅱ酶切，然后用大腸桿菌DNA聚合酶I Klenow片斷補(bǔ)平3’凹端，構(gòu)建了從下游-1236bp到+141bp的刪切質(zhì)粒，記為pREP4-m-1236CD1-CAT。應(yīng)用Kpn I和Sph I酶切，然后用T4噬菌體DNA聚合酶削平3’突出端，構(gòu)建了從下游-580bp到+

4、141bp的刪切質(zhì)粒，記為pREP4-mV580CD1-CAT。設(shè)計(jì)引物，應(yīng)用PCR方法，構(gòu)建了從下游-50到+141bp的刪切質(zhì)粒，記為pREP4-m-50CD1-CAT。應(yīng)用搭橋PCR方法構(gòu)建了“全長(zhǎng)”在-39～-30NF-κB位點(diǎn)突變的細(xì)胞周期素D1基因啟動(dòng)子報(bào)告基因質(zhì)粒，記為pREP4-m-1745CD1-nf-CAT。同時(shí)應(yīng)用PCR方法構(gòu)建了從下游-50到+141bp并且-39～-30NF-κB位點(diǎn)突變的刪切質(zhì)粒，記為pREP

5、4-m-50CD1-nf-CAT。 1．2應(yīng)用競(jìng)爭(zhēng)性半定量RT-PCR報(bào)告基因活性分析的方法確定細(xì)胞周期素D1基因啟動(dòng)子的熱休克應(yīng)答元件。在熱休克條件下，細(xì)胞周期素D1的mRNA水平下降。將在pREP4-m-CAT載體上構(gòu)建了的“全長(zhǎng)”的(-1745～+141)，刪切的(-1236～+141，-580～+141，-50～+141)以及-39～-30位的NF-кB位點(diǎn)突變的細(xì)胞周期素D1基因啟動(dòng)子的報(bào)告基因質(zhì)粒，與內(nèi)參照質(zhì)粒pM-

6、CAT共轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，熱休克處理后，應(yīng)用競(jìng)爭(zhēng)性RT-PCR方法分析報(bào)告基因活性，結(jié)果顯示，和對(duì)照組(生理?xiàng)l件)相比，在“全長(zhǎng)”以及刪切報(bào)告基因質(zhì)粒均表現(xiàn)出熱休克效應(yīng)：活性下降50％；而-39～-30位的NF-кB元件突變后熱休克效應(yīng)消失，說(shuō)明-39～-30位的NF-кB是熱休克應(yīng)答元件。 2． 應(yīng)用染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)技術(shù)，分析轉(zhuǎn)錄因子在-39～-30位點(diǎn)結(jié)合情況。 實(shí)驗(yàn)選用抗體為抗P65，mSin3A，BRM，

7、P53，Ac-H3K9，P300和PCAF。結(jié)果顯示，和對(duì)照(生理?xiàng)l件)相比P65的結(jié)合活性沒(méi)有改變，而mSin3A,P53結(jié)合活性上升。Ac-H3K9結(jié)合活性下降。mSin3A是HDACl，2等的共阻遏物，組蛋白乙?；陆?，說(shuō)明P65在熱休克后募集了去乙酰化酶造成組蛋白乙?；陆?，從而抑制轉(zhuǎn)錄活性。P53的結(jié)合活性上升，說(shuō)明p53也參與了這一抑制過(guò)程。P300和PCAF結(jié)合活性沒(méi)有改變，可能二者并不參與細(xì)胞周期素D1基因啟動(dòng)子的熱效應(yīng)

8、調(diào)節(jié)。 3．P65，TSA，HDAC，P53和BRM等對(duì)細(xì)胞周期素D1啟動(dòng)子報(bào)告基因活性的影響。 應(yīng)用共轉(zhuǎn)染技術(shù)分析啟動(dòng)子活性，分析-39～-30位的NF-кB的作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)表明共轉(zhuǎn)染P65并不能阻止細(xì)胞周期素D1基因啟動(dòng)子的熱休克效應(yīng)。轉(zhuǎn)染P65可以增強(qiáng)報(bào)告基因活性，但是并不能改變熱休克造成的啟動(dòng)子活性的下降。而FSA，HDAC類的抑制劑卻能逆轉(zhuǎn)這一效應(yīng)。共轉(zhuǎn)染HDACl，HDAC2表達(dá)質(zhì)粒分別可以抑制細(xì)胞周期素D1基因啟動(dòng)

9、子活性到60％和40％。說(shuō)明HDACs能夠抑制細(xì)胞周期素D1基因啟動(dòng)子活性，可以參與細(xì)胞周期素D1基因啟動(dòng)子的熱休克效應(yīng)調(diào)節(jié)。共轉(zhuǎn)染p53表達(dá)質(zhì)粒和細(xì)胞周期素D1基因啟動(dòng)子的-50～+141區(qū)段，以及這一區(qū)段中-39～-30位的NF-кB位點(diǎn)突變的質(zhì)粒，結(jié)果表明P53抑制細(xì)胞周期素啟動(dòng)子活性，當(dāng)-39～-30位的NF-кB位點(diǎn)突變后抑制效應(yīng)消失，說(shuō)明P53抑制細(xì)胞周期素啟動(dòng)子并且和-39～-30位的NF-кB位點(diǎn)相關(guān)。用“全長(zhǎng)”的以及“

10、全長(zhǎng)”突變的細(xì)胞周期素D1基因驅(qū)動(dòng)的報(bào)告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染染色質(zhì)重塑復(fù)合物ATP酶亞基BRM野生型(Wt-BRM)以及突變型質(zhì)粒(DN-BRM)，結(jié)果顯示BRM促進(jìn)細(xì)胞周期素D1基因啟動(dòng)子活性，熱休克時(shí)抑制細(xì)胞周期素D1基因啟動(dòng)子活性。而這一效應(yīng)在-39～-30位的NF-кB突變后消失，說(shuō)明BRM的作用和此位點(diǎn)相關(guān)。 綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)了熱休克調(diào)控的非經(jīng)典途徑：非HSE／HSF。途徑。-39～-30位的NF-κB位點(diǎn)是細(xì)胞周期素D