HBx蛋白過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞ER應(yīng)激及MANF對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響.pdf

1、HBV(hepatitisBvirus,HBV)感染易引起慢性肝炎,部分最后轉(zhuǎn)化成肝癌。最近研究表明,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmicreticulumstress,ERstress)參與了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展,但作用機(jī)制仍不明確。HBV是嗜肝DNA病毒家族的溶原性病毒,其基因組呈松弛環(huán)狀雙鏈結(jié)構(gòu),含4個(gè)開(kāi)放讀碼框架(openreadingframe,ORF),其中X區(qū)編碼產(chǎn)物(hepatitisBvirusXprotein.HBx)蛋白

2、是一種多功能的調(diào)節(jié)蛋白,在胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、病毒復(fù)制轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞增殖與凋亡、細(xì)胞周期進(jìn)程、蛋白降解和肝細(xì)胞的遺傳穩(wěn)定性等方面均有確切作用。鑒于HBx蛋白在慢性肝臟疾病發(fā)生發(fā)展中也發(fā)揮重要的作用,因此最近相關(guān)方面的研究很多。ER應(yīng)激是真核細(xì)胞的一種保護(hù)性應(yīng)激反應(yīng),它是通過(guò)激活未折疊蛋白反應(yīng)(unfoldedproteinresponse,UPR)通路,以此來(lái)減少細(xì)胞內(nèi)蛋白的異常聚集,起到細(xì)胞保護(hù)作用。研究表明它與很多因素所致疾病的發(fā)生發(fā)展密切相

3、關(guān)。MANF(mesencephalicastrocyte-derivedneurotrophicfactor,MANF)基因是我們從30000個(gè)基因中篩選出來(lái)的并對(duì)ER應(yīng)激最敏感的基因,它是一種分泌性蛋白,ER應(yīng)激能誘導(dǎo)其表達(dá)上調(diào)。我們推測(cè),MANF很可能在肝炎到肝癌的轉(zhuǎn)變中起著重要的作用,本文將對(duì)此進(jìn)行相關(guān)的研究。
　　目的:
　　建立穩(wěn)定表達(dá)乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)的HepG2穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系,并檢測(cè)HBx蛋白過(guò)度表達(dá)對(duì)

4、HepG2細(xì)胞生物學(xué)活性的影響,同時(shí)對(duì)ER應(yīng)激最敏感的基因MANF在肝癌發(fā)生發(fā)展中所起的相關(guān)作用進(jìn)行研究。
　　方法:
　　采用RT-PCR法從HepG2.2.15細(xì)胞株中克隆HBx基因編碼區(qū)片段,構(gòu)建pcDNA3.1-HBx真核表達(dá)質(zhì)粒,利用脂質(zhì)體將pcDNA3.1-HBx轉(zhuǎn)染人HepG2細(xì)胞系,通過(guò)G418篩選后,經(jīng)Westernblot法對(duì)HBx的表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證。用MTT法檢測(cè)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞的增殖活性;用PCR法檢測(cè)HBx過(guò)表

5、達(dá)引起ER應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)的變化;選擇其中變化明顯的MANF基因并將其用siRNA敲低,用MTT法檢測(cè)瞬轉(zhuǎn)細(xì)胞的增殖活性,用transwell遷移實(shí)驗(yàn)和transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)瞬轉(zhuǎn)細(xì)胞的遷移和侵襲能力的變化。
　　結(jié)果:
　　1.建立穩(wěn)定表達(dá)pcDNA3.1-HBx蛋白的細(xì)胞系
　　1.1PCR擴(kuò)增HBx基因
　　采用RT-PCR法從HepG2.2.15細(xì)胞株中克隆HBx基因編碼區(qū)片段,將擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1％的瓊

6、脂糖凝膠電泳后,約在500bp處可見(jiàn)明顯的擴(kuò)增產(chǎn)物條帶,擴(kuò)增的片段大小和理論預(yù)測(cè)值相符。
　　1.2重組質(zhì)粒陽(yáng)性克隆的篩選及鑒定
　　將上述得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收,然后與pcDNA3.1載體分別進(jìn)行雙酶切,限制酶為EcoRI和HindⅢ。酶切后將膠回收產(chǎn)物連接到pcDNA3.1載體上,連接后的產(chǎn)物在DH5α感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)化,篩選單克隆提取質(zhì)粒后再使用EcoRI和HindⅢ酶切鑒定,在465bp處有明顯的條帶,與基因P

7、CR產(chǎn)物的大小一致。并將該質(zhì)粒送到公司測(cè)序,測(cè)得的序列在基因數(shù)據(jù)庫(kù)里用BLAST對(duì)比,檢測(cè)結(jié)果與預(yù)期序列一致,提示重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-HBx構(gòu)建成功。
　　1.3Westernblot檢測(cè)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞內(nèi)HBx蛋白的表達(dá)
　　將構(gòu)建的pcDNA3.1-HBx轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞,用G418(0.5μl/ml)維持篩選,以建立穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。提取蛋白質(zhì)進(jìn)行免疫印跡檢測(cè),檢測(cè)到HBx蛋白表達(dá)的細(xì)胞表示穩(wěn)轉(zhuǎn)成功。
　　2.HB

8、x對(duì)HepG2細(xì)胞具有促增殖作用
　　MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞OD值發(fā)現(xiàn),過(guò)表達(dá)pcDNA3.1-HBx后的HepG2細(xì)胞增殖能力明顯增加,表明HBx可能對(duì)HepG2細(xì)胞具有促增殖作用。
　　3.攜帶HBV全基因組的HepG2.2.15細(xì)胞增殖活性的檢測(cè)
　　MTT法檢測(cè)HepG2和HepG2.2.15細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn),HepG2.2.15細(xì)胞的增殖活性與HepG2無(wú)顯著性差異。可能是因?yàn)镠epG2.2.15中轉(zhuǎn)染的是HBV的全

9、基因組,其對(duì)細(xì)胞的增殖調(diào)節(jié)比較復(fù)雜,表現(xiàn)出來(lái)的是綜合結(jié)果。至于真正的原因還需要進(jìn)一步的研究。
　　4.HBx蛋白對(duì)ER應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)的影響
　　選取ER應(yīng)激相關(guān)基因,檢測(cè)其在過(guò)表達(dá)HBx蛋白的HepG2細(xì)胞中的表達(dá)情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn),PERK、BiP、MANF、ATF6和XBP1在穩(wěn)轉(zhuǎn)HBx蛋白的HepG2細(xì)胞中表達(dá)升高,而IRE1、CHOP和EIF2則表達(dá)降低。這些結(jié)果提示,HBx蛋白能引起ER應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)變化?？紤]到M

10、ANF對(duì)HBx蛋白的反應(yīng)比較敏感,接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)研究MANF在肝炎到肝癌發(fā)展過(guò)程中的作用。
　　5.MANF對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移的抑制作用
　　5.1過(guò)表達(dá)MANF對(duì)肝癌細(xì)胞增殖活性的影響
　　我們前期的研究發(fā)現(xiàn),在HBV感染的肝硬化中,MANF表達(dá)增加,而在HBV陽(yáng)性的肝癌組織中,MANF的表達(dá)反而降低。前面的研究結(jié)果也顯示,HBx可以上調(diào)MANF的表達(dá)。上述結(jié)果提示,MANF在HBV感染的肝癌中發(fā)揮一定的作用。為

11、了澄清MANF對(duì)肝癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響,我們首先將MANF-FLAG質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到肝癌細(xì)胞中,用MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞活性的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn),過(guò)表達(dá)MANF對(duì)不同類型的肝癌細(xì)胞影響不同,過(guò)表達(dá)MANF可抑制SMMC-7721、HepG2、HepG2.2.15細(xì)胞及穩(wěn)轉(zhuǎn)HBx細(xì)胞的增殖,
　　5.2MANFsiRNA的驗(yàn)證
　　將MANFsiRNA轉(zhuǎn)染到HepG2細(xì)胞中,同時(shí)與未轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞和轉(zhuǎn)染空載體的HepG2細(xì)

12、胞進(jìn)行比較,其中轉(zhuǎn)染MANFsiRNA的HepG2細(xì)胞MANF表達(dá)量明顯降低,說(shuō)明MANFsiRNA能有效地抑制內(nèi)源性MANF的表達(dá)。
　　5.3沉默MANF引起肝癌細(xì)胞增殖活性增加
　　將MANFsiRNA轉(zhuǎn)染到SMMC-7721細(xì)胞中,同時(shí)轉(zhuǎn)染空載體作為對(duì)照。轉(zhuǎn)染后36h,用MTT法檢測(cè)細(xì)胞的增殖活性。除此之外還檢測(cè)HepG2.2.15,HepG2,HepG2-HBx等肝癌細(xì)胞系。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與轉(zhuǎn)染空載體的SMMC-772

13、1細(xì)胞比較,轉(zhuǎn)染MANFsiRNA的細(xì)胞增殖活性明顯增加(P<0.01),提示MANF可能對(duì)肝癌的增殖起到抑制作用。
　　5.4沉默MANF對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響
　　將MANFsiRNA轉(zhuǎn)染到肝癌細(xì)胞中,觀察相關(guān)特性變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn),敲低MANF可促進(jìn)SMMC-7721、HepG2.2.15及表達(dá)HBx的HepG2細(xì)胞的增殖。transwell實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了轉(zhuǎn)染MANFsiRNA可提高肝癌細(xì)胞的遷移率和侵襲率,提