Tim3參與巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的機(jī)制及對(duì)巨噬細(xì)胞抗原呈遞作用的研究.pdf

1、背景：T 細(xì)胞免疫球蛋白及粘蛋白家族-3（Tim3）作為T(mén)im 家族的成員，有281個(gè)氨基酸組成，最先被發(fā)現(xiàn)特異的表達(dá)在CD4+Th1 細(xì)胞上，而不在Th2 細(xì)胞上表達(dá)。這個(gè)發(fā)現(xiàn)促使人們?nèi)パ芯縏im3是如何調(diào)節(jié)Th1 型細(xì)胞反應(yīng)，又是如何在自身免疫性疾病中發(fā)揮作用？ Tim-3分子通過(guò)負(fù)性調(diào)節(jié)Th1 細(xì)胞的功能廣泛參與了特異性免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)。近期研究發(fā)現(xiàn)，Tim-3 在DC、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等天然免疫細(xì)胞表面也有表達(dá)，通過(guò)激活炎癥細(xì)胞

2、發(fā)揮促炎癥作用。
　　 目的：探討Tim-3 對(duì)巨噬細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)作用及其機(jī)制。
　　 方法：（1）首先將含Tim-3SiRNA及NC 對(duì)照序列的載體經(jīng)脂質(zhì)體分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞系RAW264.7，以G418 加壓篩選，通過(guò)RNA 干擾降低Tim3 在巨噬細(xì)胞表面的表達(dá)，構(gòu)建了一種穩(wěn)定低表達(dá)Tim3的RAW264.7 巨噬細(xì)胞系。以野生型及低表達(dá)Tim3的巨噬細(xì)胞為研究對(duì)象，探討Tim-3 對(duì)巨噬細(xì)胞活性及表型的影響。（2）體外

3、阻斷或激活Tim3通路，ELISA法檢測(cè)巨噬細(xì)胞等天然免疫細(xì)胞分泌炎癥因子TNF-α、IL-6的水平；通過(guò)Western blot 方法檢測(cè)炎癥反應(yīng)信號(hào)通路中關(guān)鍵分子AKT、PAKT、NF-kB的變化；通過(guò)ELISA法、Western blot 檢測(cè)Tim-3 與模式識(shí)別受體TLR4的相互作用。雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)NF-kB的活性。通過(guò)以上方法檢測(cè)Tim3 參與巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的機(jī)制。(3)建立敗血癥動(dòng)物模型，觀察Tim3 在敗血

4、癥早期和晚期的不同作用。(4)以敗血癥小鼠模型為基礎(chǔ)，Tim-3 體內(nèi)阻斷實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Th1、Th17 細(xì)胞活性，研究Tim-3 對(duì)Th1,Th17的分化的影響以及對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞表面共刺激分子CD80、CD86的表達(dá)的影響。同時(shí)體外實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Tim3 對(duì)巨噬細(xì)胞表面共刺激分子CD86/CD80表達(dá)比例的影響以及對(duì)Th1,Th17的分化的影響。從體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和體外實(shí)驗(yàn)兩方面探討Tim3 對(duì)巨噬細(xì)胞抗原呈遞作用及對(duì)Th1,Th17 細(xì)胞極化的影響

5、。
　　 結(jié)果：（1）成功構(gòu)建了重組載體Tim3-siRNA，建立了穩(wěn)定低表達(dá)Tim3的巨噬細(xì)胞系。(2)為了探討Tim-3 在天然免疫中的調(diào)節(jié)作用，我們觀察了Tim-3 對(duì)巨噬細(xì)胞活性的影響，結(jié)果顯示Tim-3 刺激巨噬細(xì)胞分泌炎癥因子TNF-α、IL-6。同時(shí)ELISA 結(jié)果顯示Tim3 通路和TLR4 通路在刺激巨噬細(xì)胞釋放炎性因子TNF-α方面存在相互拮抗效應(yīng)。
　　 Western blot 結(jié)果也顯示Tim3

6、 信號(hào)通路和TLR4 信號(hào)通路的相互拮抗關(guān)系涉及到對(duì)一些重要的信號(hào)分子的影響，如AKT活性過(guò)強(qiáng)抑制了NF-kB活性，從而抑制了LPS 介導(dǎo)的TNF-α的分泌。（3）體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，以敗血癥小鼠模型為基礎(chǔ)，Tim-3 在敗血癥早期表達(dá)升高，發(fā)揮抗炎作用，而在敗血癥后期表達(dá)失調(diào)。（4）體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Tim-3 在提高CD86，降低CD80，提高CD86/CD80的比例中發(fā)揮重要作用。同時(shí)Tim-3可以促進(jìn)Th1及Th17 細(xì)胞的分

7、化，表現(xiàn)為T(mén)h1 型細(xì)胞因子IFN-γ，以及Th17 型細(xì)胞因子IL-17表達(dá)的升高。
　　 小結(jié)：（1）Tim3 通過(guò)促使巨噬細(xì)胞分泌炎癥因子TNF-α、IL-6 參與了天然免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)。（2）Tim3 通路和TLR4 信號(hào)通路在介導(dǎo)炎癥反應(yīng)方面存在相互拮抗效應(yīng)。（3）Tim3參與了巨噬細(xì)胞表面CD80，CD86 共刺激分子的調(diào)節(jié)，Tim-3 通過(guò)提高CD86/CD80的比例促進(jìn)Th1及Th17 細(xì)胞的分化。（4）本實(shí)驗(yàn)為認(rèn)識(shí)