鈣結(jié)合蛋白D28k在小鼠腎臟發(fā)生發(fā)育中的表達(dá).pdf

1、目的:觀察鈣結(jié)合蛋白D28k(Calbindin-D28k)在小鼠腎臟發(fā)生發(fā)育中的表達(dá)規(guī)律及定位，探討Calbindin-D28k在小鼠腎臟發(fā)生發(fā)育中的作用。 方法:選取體重25～30g健康成年昆明小白鼠，采用檢查陰道栓脫落的方法確定其受孕后，選取胚齡(E)10、12、14、16、18天的胎鼠和生后日齡(N)1、3、7、14、21、40天的仔鼠，每組取8只鼠。將各胚(日)齡小鼠剖腹取出腎臟，常規(guī)制作石蠟切片。應(yīng)用光鏡技術(shù)(LM)

2、對不同發(fā)育階段的小鼠腎臟進(jìn)行觀察；應(yīng)用免疫組織化學(xué)(IHC)染色(SABC法)及免疫熒光技術(shù)(IFT)對各組小鼠腎臟Calbindin-D28k表達(dá)進(jìn)行定性觀察；應(yīng)用圖像分析方法(CLAS-1000型細(xì)胞圖像分析系統(tǒng))對各組小鼠腎臟Calbindin-D28k表達(dá)進(jìn)行定量檢測；應(yīng)用蛋白印跡技術(shù)(Westernblotting)對不同發(fā)育階段小鼠腎臟Calbindin-D28k表達(dá)進(jìn)行定量測定。 結(jié)果: 1.光鏡結(jié)果：

3、 胚齡12天，輸尿管芽出現(xiàn)，在輸尿管芽周圍圍繞生后腎組織。胚齡14天，生腎區(qū)出現(xiàn)，即在輸尿管芽分支周圍出現(xiàn)了小泡體、逗號(hào)小體、S小體。胚齡16天，Ⅲ、Ⅳ期腎小體出現(xiàn)。胚齡18天，早期髓質(zhì)出現(xiàn)，其間散在大量間質(zhì)，相當(dāng)于成年后的髓質(zhì)外帶外區(qū)。生后1天，腎臟被膜下生腎區(qū)面積減少，可見腎乳頭。生后7天，皮質(zhì)生腎區(qū)消失，腎小體發(fā)育基本成熟，輸尿管芽消失，髓放線出現(xiàn)，可見近直小管，遠(yuǎn)直小管和集合管，腎乳頭可見髓質(zhì)外帶內(nèi)區(qū)。生后14天，皮質(zhì)增厚，

4、髓質(zhì)可區(qū)分為髓質(zhì)外帶內(nèi)外區(qū)。生后21天，皮質(zhì)厚度明顯增加，腎乳頭內(nèi)側(cè)可見髓質(zhì)內(nèi)帶，集合管數(shù)量增多。生后40天，腎及腎小體的發(fā)育達(dá)到成年水平，髓質(zhì)外帶以及內(nèi)帶清晰與成鼠完全相同。 2.免疫組織化學(xué)染色結(jié)果： 胚齡10天，Calbindin-D28k在胎鼠腎臟中未見表達(dá)。胚齡12天，Calbindin-D28k在輸尿管芽有所表達(dá)，表達(dá)強(qiáng)度比較微弱，生后腎組織未見表達(dá)。胚齡14天，Calbindin-D28k在輸尿管芽分支表達(dá)

5、增強(qiáng)，生腎區(qū)未見表達(dá)。胚齡16天，Calbindin-D28k在輸尿管芽壺腹表達(dá)強(qiáng)烈，腎小管和S小體未見表達(dá)，然而S小體與輸尿管芽壺腹連接處表達(dá)。胚齡18天到生后3天，腎小囊、近端小管、髓袢未見表達(dá)，而遠(yuǎn)端腎單位表達(dá)增強(qiáng)。生后7天，Calbindin-D28k定位于腎臟的遠(yuǎn)曲小管、連接小管、皮質(zhì)集合管。生后14天、21天、40天Calbindin-D28k在小鼠腎臟均有表達(dá)，其表達(dá)強(qiáng)度減弱且趨于穩(wěn)定。Calbindin-D28k在小鼠腎

6、臟的表達(dá)部位在細(xì)胞胞漿內(nèi)。 3.CLAS-1000型細(xì)胞圖像分析系統(tǒng)檢測： 腎臟發(fā)育不同時(shí)期Calbindin-D28k表達(dá)的灰度值有明顯的差異：胚齡12天，Calbindin-D28k表達(dá)的灰度值最高，Calbindin-D28k有一定表達(dá)。從胚齡12天到生后7天，Calbindin-D28k表達(dá)的灰度值降低，表達(dá)量逐漸增加，生后7天達(dá)高峰。從生后14天到生后40天，Calbindin-D28k表達(dá)量減少并趨于穩(wěn)定，差

7、異無顯著性意義。 4.免疫熒光結(jié)果： Calbindin-D28k在胚齡10天胎鼠腎臟未見表達(dá)，胚齡12天在輸尿管芽微量表達(dá)，胚齡14天在輸尿管芽Y型分支表達(dá)，表達(dá)增強(qiáng)，胚齡16天在輸尿管芽壺腹表達(dá)強(qiáng)烈，且在腎單位與輸尿管芽壺腹連接部有少量表達(dá)。胚齡18天到生后7天，Calbindin-D28k表達(dá)逐漸增強(qiáng)，并定位于遠(yuǎn)曲小管、連接小管、皮質(zhì)集合管。生后7天到生后40天，Calbindin-D28k在遠(yuǎn)曲小管、連接小管、皮

8、質(zhì)集合管表達(dá)豐富，在髓質(zhì)集合管表達(dá)下降。Calbindin-D28k表達(dá)部位在輸尿管芽或遠(yuǎn)曲小管、連接小管、皮質(zhì)集合管上皮細(xì)胞胞漿內(nèi)。 5.Western blotting結(jié)果： 胚齡12天，Calbindin-D28k表達(dá)量極低，無法檢測。胚齡14天到胚齡16天，Calbindin-D28k表達(dá)量增加，差異有顯著性意義[(12.0994±0.6911)，(13.2383±0.1729)，P<0.01]。胚齡16天到胚齡

9、18天，Calbindin-D28k表達(dá)量無顯著性差異。胚齡18天到生后7天，Calbindin-D28k表達(dá)量明顯增加，差異有顯著性意義[(13.8447±0.2385)， (15.2718±0.2019)， (16.3208±0.2839)，(19.3383±0.4044)，P<0.01]。生后7天到生后14天，Calbindin-D28k表達(dá)量減少，差異有顯著性意義[(19.3383±0.4044)，(15.8915±1.0185

10、)，P<0.01]。生后14天到生后40天，Calbindin-D28k表達(dá)量無顯著性差異。 結(jié)論: 1．在小鼠腎臟發(fā)生發(fā)育中，Calbindin-D28k在胚齡12天胎鼠腎臟輸尿管芽微弱表達(dá)，隨胚(日)齡增加其表達(dá)量逐漸增加，生后7天達(dá)最大水平，并定位于遠(yuǎn)曲小管、連接小管和皮質(zhì)集合管，此后表達(dá)量減少并趨于平穩(wěn)。 2．Calbindin-D28k表達(dá)部位在輸尿管芽或遠(yuǎn)曲小管、連接小管、皮質(zhì)集合管上皮細(xì)胞胞漿內(nèi)。