微顆粒在脂氧素合成和腫瘤治療中的作用.pdf

1、[目的]在炎癥發(fā)生時(shí),花生四烯酸經(jīng)過(guò)脂加氧酶的催化下產(chǎn)生促炎癥消退的脂類介質(zhì)脂氧素A4。經(jīng)過(guò)多年的研究發(fā)現(xiàn)脂氧素在炎癥的消退的過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用,然而脂氧素的產(chǎn)生機(jī)制仍然沒(méi)有被完全闡明。本研究通過(guò)對(duì)血小板來(lái)源微顆粒的檢測(cè),從細(xì)胞和動(dòng)物模型分別進(jìn)行了研究,從新的角度闡明了體內(nèi)和體外脂氧素合成的又一新的途徑和機(jī)制。
　　[方法]
　　1.血小板來(lái)源微顆粒的分離與制備
　　人或者鼠的外周血抗凝后提取血清中的血小板,經(jīng)10

2、μMADP刺激后,利用高速離心的方法14000g×1h后提取血小板釋放的微顆粒。
　　2.血小板微顆粒中12-LO的檢測(cè)
　　將血小板來(lái)源的微顆粒提取后,用NP-40裂解液提取其總蛋白,然后采用免疫印跡的方法檢測(cè)其12-LO的表達(dá)。
　　3.經(jīng)血小板來(lái)源微顆粒治療后,LPS誘導(dǎo)的炎癥模型中的相關(guān)因子的檢測(cè)
　　18-20gBalb/c小鼠腹腔注射2μgLPS1h后,再腹腔注射血小板來(lái)源的微顆粒。5h后,取腹腔灌洗

3、細(xì)胞和灌洗液檢測(cè)相關(guān)炎癥因子IFN-γ,IL-6,IL-10,CCL2和iNOS的表達(dá)。
　　4.經(jīng)血小板來(lái)源微顆粒治療后,DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型中的相關(guān)因子的檢測(cè)
　　18-20gBalb/c小鼠飲用含3.5％DSS的飲用水,同時(shí)每只小鼠每天腹腔注射1×106血小板來(lái)源的微顆粒,每天記錄體重。5-7天后,處死小鼠,觀察結(jié)腸的變化并檢測(cè)相關(guān)炎性因子IL-18,IFN-γ和TNF-α的表達(dá)。
　　[結(jié)果]
　　1.

4、血小板來(lái)源的微顆粒中包含著12-LO
　　人或者鼠的外周血抗凝后提取血清中的血小板,經(jīng)10μMADP刺激后,利用高速離心的方法14000g×1h后提取血小板釋放的微顆粒。將血小板來(lái)源的微顆粒提取后,用NP-40裂解液提取其總蛋白,然后采用免疫印跡的方法檢測(cè)其12-LO的表達(dá)。結(jié)果顯示對(duì)照組和經(jīng)ADP刺激的血小板來(lái)源的微顆粒中都有12-LO的表達(dá)。
　　2.在體外肥大細(xì)胞攝取血小板來(lái)源的微顆粒后可以產(chǎn)生LXA4
　　將骨

5、髓來(lái)源誘導(dǎo)的肥大細(xì)胞與血小板來(lái)源的微顆粒進(jìn)行共孵育,12h后用ELISA的方法檢測(cè)培養(yǎng)上清中LXA4的表達(dá)。結(jié)果顯示,僅在二者共孵育的上清中可以檢測(cè)到LXA4的表達(dá),而在單獨(dú)的肥大細(xì)胞和單獨(dú)的微顆粒培養(yǎng)上清中則沒(méi)有LXA4的表達(dá)。
　　3.在體內(nèi)腹腔肥大細(xì)胞可以攝取血小板來(lái)源的微顆粒并產(chǎn)生LXA4
　　將血小板來(lái)源的微顆粒用紅色膜染料PKH26染成紅色后腹腔注射到Balb/c腹腔中,6h后取腹腔細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞染色,并取腹腔

6、灌洗液檢測(cè)LXA4的水平。結(jié)果顯示大部分c-kit陽(yáng)性的細(xì)胞(80.4%)都顯示PKH26陽(yáng)性,并且在腹腔灌洗液檢測(cè)到了LXA4的表達(dá)。
　　4.體內(nèi)腹腔肥大細(xì)胞吞噬血小板來(lái)源的微顆粒產(chǎn)生的LXA4可以抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥
　　18-20gBalb/c小鼠腹腔注射2μgLPS1h后,再腹腔注射血小板來(lái)源的微顆粒。5h后,取腹腔灌洗細(xì)胞和灌洗液檢測(cè)相關(guān)炎癥因子IFN-γ,IL-6,IL-10,CCL2和iNOS的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)

7、,血小板來(lái)源的微顆粒注射組和LXA4注射組中IFN-γ表達(dá)均下降,而IL-10的表達(dá)則明顯增加。
　　5.體內(nèi)腹腔肥大細(xì)胞吞噬血小板來(lái)源的微顆粒產(chǎn)生的LXA4可以抑制DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎
　　18-20gBalb/c小鼠飲用含3.5%DSS的飲用水,同時(shí)每只小鼠每天腹腔注射1×106血小板來(lái)源的微顆粒,每天記錄體重。5-7天后,處死小鼠,觀察結(jié)腸的變化并檢測(cè)相關(guān)炎性因子IL-18,IFN-γ和TNF-α的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),血小板