Mdr-1基因siRNA表達載體聯(lián)合磁性納米Fe-,3-O-,4-逆轉K562-A02細胞多藥耐藥的研究.pdf

1、目的：研究發(fā)夾狀小分子干擾RNA（small RNA interference，siRNA）聯(lián)合磁性納米四氧化三鐵顆粒[magnetic nanoparticle of Fe3O4，MNP（Fe3O4）]逆轉白血病多藥耐藥細胞株K562/AO2多藥耐藥的作用及其逆轉耐藥的效果，為臨床白血病的治療提供一定的理論依據(jù)。
　　 方法:（1）分別以mdr-1 mRNA第3491-3509，1539-1557和3103-3121核苷酸作為

2、靶點，合成針對靶區(qū)域序列的發(fā)夾狀RNA（short hairpin RNA，shRNA）克隆入pGCSilencer-U6-Ne0-GFP載體，重組質粒分別為PGY1-1，PGY1-2和PGY1-3。應用聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）和序列測定以證實重組質粒打靶序列的正確性。（2）因該載體同時表達GFP標記基因，熒光顯微鏡下觀察在脂質體介導下轉染K562/AO2細胞足否發(fā)綠色熒光，計算轉染效率

3、。（3）轉染K562/AO2細胞株后篩選陽性表達載體，篩選出mdr-1基因抑制率最高的載體，然后與攜載有柔紅霉素（daunorubicinDNR）的MNP（Fe3O4）共培養(yǎng)48h。（4）采用實時定量逆轉錄聚合酶鏈反應（real time reversetranscript polymerase chain reaction，Real time RT-PCR）檢測mdr-1基因mRNA轉錄情況。（5）蛋白免疫印跡法（western bl

4、ot，WB）法觀察P糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）的表達。（6）應用流式細胞術（flow cytometry，F(xiàn)CM）檢測細胞內柔紅霉素的濃度。
　　 結果:（1）成功構建mdr-1基因siRNA表達載體，PCR電泳圖譜和測序結果顯示重組質粒的打靶序列完全正確。（2）熒光顯微鏡下K562/AO2細胞的轉染效率為（19.9±1.2）％。（3）重組質粒PGY1-1，PGY1-2和PGY1-3中，PGY1-2對mdr

5、-1基因轉錄抑制率最高且P-gp的表達量最低。（4）Real time RT-PCR檢測細胞mdr-1mRNA的轉錄情況：①K562細胞mdr-1 mRNA轉錄為陰性，K562/AO2細胞mdr-1mRNA轉錄為陽性。②單用PGY1-2或攜載DNR的MNP（Fe3O4）均能下調K562/A02細胞的mdr-1mRNA轉錄，當PGY1-2和攜載DNR的MNP（Fe3O4）聯(lián)合作用于K562/A02細胞時，mdr-1mRNA轉錄明顯降低，與

6、二者單獨應用時相比，差別有統(tǒng)計學意義（p<0.05）。（5）Western blot法檢測P-gp表達結果顯示：與K562細胞相比，K562/A02細胞的P-gp表達水平較高。與K562/A02細胞空白對照組相比，10μg/ml MNP（Fe3O4）或PGY1-2單獨作用時，均可降低K562/A02細胞的P-gp水平，差別有統(tǒng)計學意義（p<0.05）。與單用1.0μg/ml DNR相比，10μg/mlMNP（Fe3O4）攜載1.0μg/

7、ml的DNR或經(jīng)PGY1-2轉染和1.0μg/mlDNR處理，K562/A02細胞的P-gP水平下調更明顯，差別有統(tǒng)計學意義（p<0.05）。當轉染了PGY1-2的K562/A02細胞與攜載1.0μg/ml DNR的10μg/ml MNP（Fe3O4）共培養(yǎng)48h后，P-gp水平下調最明顯，與單用1.0μg/ml DNR組，10μg/ml MNP（Fe3O4）+1.0μg/ml DNR組和PGY1-2+1.0μg/ml DNR組相比，差

8、別具有統(tǒng)計學意義（p<0.05）。（6）流式結果顯示：單用PGY1-2或攜載DNR的MNP（Fe3O4）均能使K562/A02細胞內DNR濃度增加，當PGY1-2和攜載DNR的MNP（Fe3O4）聯(lián)合作用時K562/A02細胞內DNR濃度增加最明顯，差別有統(tǒng)計學意義（p<0.05）。K562/A02分別經(jīng)，空白對照組（K562/A02），DNR，DNR和MNP（Fe3O4），DNR和PGY1-2，DNR、MNP（Fe3O4）和PGY1-

9、2，處理后細胞內藥物濃度分別為：170±12，2490±19，3318±22，5513±20，6930±12。
　　 結論:1.攜載有DNR的磁性納米Fe3O4顆?？梢韵抡{K562/A02細胞mdr-1mRNA的轉錄和降低P-gp水平的表達。2.mdr-1基因siRNA表達載體轉染K562/A02細胞時可以下調mdr-1mRNA的轉錄和降低P-gp水平的表達。3.mdr-1基因siRNA表達載體和攜載有DNR的磁性納米Fe3O4