mdr-1 shRNA、Nef逆轉K562-A02細胞MDR及增強STI571對耐藥細胞敏感性的研究.pdf

1、研究背景: 化療藥物治療腫瘤失敗的主要原因是腫瘤細胞對藥物產生耐藥性。多藥耐藥(MDR)是指腫瘤細胞接觸一種抗癌藥物后產生的對多種結構和功能迥異的抗癌藥物的耐受性。MDR的發(fā)生涉及多種機制，其中以腫瘤細胞過度表達mdr-1基因編碼的ABC轉運蛋白超家族成員膜P-糖蛋白為主要的機制。MDR藥物調節(jié)劑或增敏劑能通過抑制P-gp的外泵功能來阻止MDR的發(fā)生。但是它們的心臟毒性、免疫抑制、高膽紅素血癥、腎臟毒性等嚴重毒性和不良反應限制了

2、臨床應用。另外，腫瘤細胞對這類化療增敏劑同樣能產生再次耐藥。因此有必要探尋毒性更低、更有效的方法來逆轉MDR。 在以往的研究中，反義寡核苷酸能有效地逆轉P-gp參與的MDR。而且核酶技術亦能有效地下調mdr-1 mRNA的表達。而近年來，RNA干擾(RNAi)由于其高效性，高特異性，高穩(wěn)定性，可遺傳性及RNAi在有效地沉默靶基因的同時，對細胞本身的調控系統(tǒng)沒有影響等這些特點，越來越為人們重視。RNA干擾是利用雙鏈RNA(dsRN

3、A)誘導序列特異的轉錄后基因沉默現(xiàn)象?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)RNA干擾現(xiàn)象廣泛存在于從植物、真菌、昆蟲、蛙類、鳥類、大鼠、小鼠到人類的幾乎所有真核生物中。從低等生物到高等動物廣泛存在RNA干擾機制，這說明RNA干擾機制在進化的很早階段就已經產生，是生物體進化過程中的一種保守機制。RNA干擾機制經過了千萬年選擇與進化，是一種古老而多能的細胞水平的監(jiān)督系統(tǒng)(細胞內的免疫系統(tǒng))。通過此系統(tǒng)，細胞可以去除不需要的mRNA，降解畸變的RNAs，以及抑制如病毒、

4、轉基因、移位元件等的外源基因成分。RNAi技術利用外源性雙鏈RNA，產生約21～23個堿基大小的有活性的小干擾RNA(siRNA)，誘導產生序列特異性基因沉默。其作用類似于基因敲除，但技術上更為簡單、快捷。有研究小組開發(fā)表達載體在瞬時轉染和穩(wěn)定轉染的哺乳動物細胞中持續(xù)表達siRNA，一些載體經過設計可以表達短發(fā)夾狀RNA(shRNA)，在體內加工后形成類似siRNA的分子，引發(fā)基因沉默。shRNA一般都是在RNA多聚酶Ⅲ(Pol Ⅲ)啟

5、動子和4～5個T的轉錄終止位點之間插入，轉錄產物在轉錄終止位點的第二個堿基處終止，然后折疊成發(fā)夾結構，最后shRNA在體內被加工處理成為siRNA，起始RNAi的過程。此類表達載體介導的基因沉默作用時間長而且更穩(wěn)定，甚至可長期抑制基因表達。本實驗所構建的質粒載體能表達綠色熒光蛋白，有利于測定轉染效率，另外此載體帶有Rneo基因，可用于真核細胞轉染后的G418篩選，為獲得帶有目的片斷的單細胞克隆提供了方便。 盡管RNAi具有抑制率

6、高，特異性強的特點，但其轉導入細胞內轉染效率較低，而且siRNA干擾效應具有濃度依賴性，其效應隨濃度增高而增加，但是過量的dsRNA則會激活ADARs(RNA依賴的腺苷脫氨酶)的活性，通過脫氨基作用反而抑制RNAi。這些缺點影響了RNAi的干擾效應。 由蓮心、黃芪等組成的拮新康是導師多年來潛心研制的中藥復方制劑。研究證明能增加腫瘤細胞對化療藥物的敏感性而逆轉MDR，而藥理研究表明蓮心中主要有效成分為甲基蓮心堿(Nef)，曾采用甲

7、基蓮心堿對K562／AO2多藥耐藥細胞進行干預，發(fā)現(xiàn)甲基蓮心堿能增加阿霉素(ADM)在K562／AO2細胞內的積聚濃度，降低mdr-1／P-gp基因表達而逆轉MDR。mdr-1 shRNA能否抑制K562／AO2細胞mdr-1／P-gp基因表達，甲基蓮心堿能否增強RNAi對mdr-1／P-gp的干擾效應，值得深入探討。 酪氨酸激酶抑制劑STI57 1(格列衛(wèi))作為針對腫瘤發(fā)病特異的癌基因靶向分子設計的藥物，目前認為是治療Ph陽性

8、慢性粒細胞白血病最有效的藥物。STl57l競爭bcr／abl酪氨酸激酶的ATP結合位點，選擇性抑制酪氨酸激酶的活性。STl571獲得性多藥耐藥已成為治療慢粒的難點。而P-gp表達上調在STI571獲得性多藥耐藥中起著一定的作用。逆轉P-gp參與的STI571耐藥，從而提高STl57l對慢粒白血病的療效具有一定的參考意義。 一、pEGFP—C1／U6質粒介導的表達mdr-1 shRNA的質粒構建 目的：利用基因重組技術，用

9、pEGFP—CI／U6質粒載體構建介導mdr-1shRNA的表達質粒。方法：針對mdr-1基因的19個堿基大小的片段，分別設計2對寡核苷酸，形成雙鏈后將其依次連入帶有U6啟動子的pEGFP-C1載體(命名為pEGFP—C1／U6)，兩對DNA雙鏈連接后形成中間由9個堿基序列間隔的反向互補序列，構建成能產生mdr-l shRNA的質粒。同時設計1對與人mdr-1基因無同源性的隨機寡核苷酸，構建一陰性對照重組質粒。結論：成功構建了能表達md

10、r-1shRNA的質粒載體pEGFP-C1／U6／A和pEGFP-C1／U6／B和一陰性對照質粒pEGFP-C1／U6／neg，可能為臨床上逆轉腫瘤多藥耐藥提供一種有效的方法。 二、mdr-1 shRNA對K562／A02細胞mdr-1／P-gp表達及功能的影響 目的：研究mdr-1 shRNA對K562／AO2細胞mdr-1／P—gp表達及功能的影響，為逆轉腫瘤多藥耐藥提供新的方法與思路。方法：通過脂質體轉染質粒pEG

11、FP-C1／U6／A、pEGFP-C1／U6／B和pEGFP-C1／U6／neg至K562／AO2細胞株，采用逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)和蛋白質免疫印跡(Western-Blot)技術檢測mdr-1／P-gp表達的改變。四唑鹽法(MTT法)檢測阿霉素對K562／AO2細胞增殖的影響。HPLC法觀察質粒pEGFP-C I／U6／A、pEGFP-C 1／U6／B和pEGFP-C 1／U6／neg對K562／AO2細胞內阿霉素積聚濃度

12、的影響。結論：mdr-1 shRNA可明顯抑制K562／AO2細胞mdr-1／P-gp的表達，增加K562／AO2細胞內阿霉素含量，恢復K562／AO2細胞對化療藥物的敏感性，逆轉mdr-1基因編碼蛋白P-gp介導的MDR。 三、mdr-1 shRNA聯(lián)合甲基蓮心堿對K562／AO2細胞mdr-1／P-gp表達及功能的影響 目的：研究mdr-1 shRNA聯(lián)合甲基蓮心堿對K562／A02細胞mdr-1／P-gp表達及功能

13、的影響,為更有效地逆轉腫瘤多藥耐藥探尋新的思路。方法:脂質體轉染質粒pegfp-c1/u6/b或聯(lián)用甲基蓮心堿處理k562/a02細胞,采用rt-pcr和western-blot技術檢測mdr-1/p-gp表達的改變。mtt法檢測阿霉素對k562/a02細胞增殖的影響。結論:甲基蓮心堿能顯著增強shrna表達載體對k562/a02細胞mdr-1/p-gp表達抑制作用,恢復k562/a02細胞對化療藥物的敏感性,逆轉mdr-1基因編碼蛋白

14、p-gp介導的多藥耐藥。 四、mdr-1 shrna及甲基蓮心堿在k562/a02細胞對st1571敏感性中作用的研究 目的:研究mdr-1 shrna、甲基蓮心堿在多藥耐藥白血病細胞k562/a02對st1571敏感性中的作用,并探討其逆轉耐藥的機制。方法:脂質體轉染質粒pegfp-c1/u6/b或聯(lián)用甲基蓮心堿處理k562/a02細胞株,mtt法檢測st1571對k562/a02細胞增殖的影響。rt-pcr和west