豬圓環(huán)病毒2型激活鈣離子信號(hào)通路誘導(dǎo)PK-15細(xì)胞自噬.pdf

1、豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type2，PCV2)是導(dǎo)致豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病(Porcine circovirus-associated disease，PCVAD)的主要致病因子，主要感染豬體免疫器官，造成淋巴組織損傷、淋巴細(xì)胞減少及組織細(xì)胞浸潤(rùn)等病理學(xué)特征，最終可導(dǎo)致嚴(yán)重的免疫抑制。此外，PCV2感染后極易導(dǎo)致豬群繼發(fā)感染和混合感染，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重?fù)p失。PCV2基因組全長(zhǎng)1.7 kb，為共價(jià)閉合、環(huán)狀單鏈D

2、NA。迄今已報(bào)道PCV2有5個(gè)ORF編碼蛋白:ORF1編碼復(fù)制相關(guān)蛋白Pep，負(fù)責(zé)病毒DNA的復(fù)制;ORF2編碼核衣殼蛋白Cap，與病毒粒子包裝及細(xì)胞自噬有關(guān)，也是PCV2主要的免疫原性蛋白;ORF3編碼蛋白能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡;ORF4編碼蛋白能夠抑制細(xì)胞凋亡，調(diào)控宿主T淋巴細(xì)胞;ORF5編碼蛋白能夠誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。細(xì)胞自噬在病毒的感染、復(fù)制以及致病方面均發(fā)揮重要作用，本實(shí)驗(yàn)室前期工作證實(shí)PCV2感染PK-15細(xì)胞可通過(guò)AMPK/ERK/

3、TSC2/mTOR途徑誘導(dǎo)細(xì)胞自噬以促進(jìn)自身復(fù)制，但激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)的分子機(jī)制尚待進(jìn)一步揭示。
　　本研究旨在闡明:(1) PCV2感染PK-15細(xì)胞激活A(yù)MPK的分子機(jī)制;(2)PCV2感染PK-15細(xì)胞除激活A(yù)MPK/ERK/TSC2/mTOR通路以外，是否有其它的自噬通路參與;(3) PCV2Cap蛋白誘導(dǎo)自噬的關(guān)鍵區(qū)域。
　　1.PCV2感染PK-15細(xì)胞經(jīng)由CaMKKβ激活A(yù)MPK
　　利用

4、RNA干擾、免疫印跡、激光共聚焦及實(shí)時(shí)熒光定量PCR(q-RT-PCR)等方法對(duì)PCV2感染PK-15細(xì)胞激活A(yù)MPK的分子機(jī)制進(jìn)行探究。免疫印跡結(jié)果表明，PCV2感染PK-15細(xì)胞后24 h開(kāi)始顯著上調(diào)鈣/鈣調(diào)素依賴的蛋白激酶的激酶β(CaMKKβ)（1.00 vs2.20，P＜0.05），激活其底物分子AMPK(1.00 vs2.59，P＜0.01)和鈣調(diào)蛋白激酶Ⅰ(CaMKI)（1.00 vs2.37，P＜0.05）;CaMKKβ

5、抑制劑STO-609或特異性小干擾RNA(siCaMKKβ)均能顯著抑制PCV2誘導(dǎo)的AMPK和CaMKI的活化。激光共聚焦結(jié)果顯示，STO-609或siCaMKKβ均能顯著抑制PCV2誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)自噬小體的形成（14.6 vs28.5，P＜0.01;19.2 vs29.0，P＜0.01）;q-RT-PCR及病毒滴度測(cè)定顯示，抑制CaMKKβ（STO-609或siCaMKKβ）均能顯著降低子代PCV2 DNA拷貝數(shù)(106.02 vs1

6、08.23;106.91 vs108.36，P＜0.01)及病毒滴度(TCID50)（10-2.23 vs10-4.56，P＜0.01;10-2.85 vs10-4.35, P＜0.01）。這些結(jié)果表明，PCV2感染PK-15細(xì)胞經(jīng)由CaMKKβ激活A(yù)MPK及其下游通路誘導(dǎo)細(xì)胞自噬。
　　2.PCV2感染PK-15細(xì)胞激活CaMKKβ/CaMKUWIPI1自噬通路
　　利用RNA干擾、免疫印跡、激光共聚焦及q-RT-PCR等

7、技術(shù)對(duì)PCV2感染PK-15細(xì)胞是否激活CaMKKβ/CaMKI/WIPI1自噬通路進(jìn)行探究。結(jié)果顯示，PCV2感染后12 h便能顯著上調(diào)與磷酸肌醇互作的色氨酸一天冬氨酸重復(fù)蛋白1(WIPI1)的mRNA（1.00vs2.60，P＜0.01）及其蛋白水平（1.00 vs1.92，P＜0.05），而特異性小干擾RNA siWIPI1或siCaMKI以及CaMKI抑制劑KN93均能顯著抑制PCV2的復(fù)制及其誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬。此外，siAMPK

8、能夠抑制PCV2誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬，但不影響CaMKI活化和WIPI1上調(diào)。激光共聚焦結(jié)果顯示，PCV2感染能夠促進(jìn)DsRed-WlPI1點(diǎn)狀聚集（47.0 vs24.5，P＜0.01）及DsRed-WIPl1/EGFP-LC3共定位(16.7 vs8.7，P＜0.01)，這種促進(jìn)作用能被STO-609或KN93緩解。以上結(jié)果表明，PCV2感染能夠激活CaMKKβ/CaMKI/WIPI1通路誘導(dǎo)自噬，且不依賴于AMPK。
　　3.PC

9、V2感染PK-15細(xì)胞經(jīng)由IP3R-Ca2+途徑激活CaMKKβ
　　利用免疫印跡、ELISA和流式細(xì)胞術(shù)等技術(shù)進(jìn)一步探究PCV2感染激活CaMKKβ以及Cap蛋白誘導(dǎo)自噬的分子機(jī)制?；诹魇郊?xì)胞術(shù)和熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)方法的細(xì)胞漿Ca2+檢測(cè)顯示，PCV2感染后36 h能顯著上調(diào)胞漿游離Ca2+水平(128.7％ vs100％，P＜0.01)，并顯著提高TN-XXL蛋白的FRET發(fā)生效率(14.1％ vs2.0％，P＜0

10、.01)。這種上調(diào)作用能被三磷酸肌醇受體(IP3R)抑制劑2-APB緩解。免疫印跡顯示，2-APB能夠抑制PCV2感染對(duì)CaMKKβ/AMPK和CaMKKβ/CaMKI自噬通路的激活以及PCV2復(fù)制，而PCV2感染并未激活磷酯酶C-γ（PLC-γ）。ELISA顯示PCV2感染未上調(diào)細(xì)胞內(nèi)三磷酸肌醇(IP3)水平，說(shuō)明PCV2激活I(lǐng)P3R不是經(jīng)由PLC-IP3途徑。Cap及其截短表達(dá)載體(pCap、pCap1-100aa、 pNLS+Ca

11、p90-190aa及pNLS+Cap185-233aa)轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞均能不同程度的上調(diào)細(xì)胞漿內(nèi)Ca2+水平，并誘導(dǎo)自噬，且與Cap蛋白的核定位信號(hào)（Cap1-41 aa，NLS）無(wú)關(guān)，Cap蛋白的aa42-185可能起主要作用。此外，Cap及其截短表達(dá)不能誘導(dǎo)HEK293細(xì)胞發(fā)生自噬。以上結(jié)果表明，PCV2感染PK-15細(xì)胞經(jīng)由Cap蛋白通過(guò)IP3R-Ca2+途徑激活CaMKKβ。
　　綜上所述，本研究進(jìn)一步闡明了PCV2感