葛根素調(diào)節(jié)支架內(nèi)狹窄炎癥反應(yīng)的機(jī)制研究.pdf

1、目的與背景： 1987年支架在臨床實(shí)踐中的應(yīng)用是經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療(PCI)領(lǐng)域中的一個(gè)里程碑，其后的10余年來，冠狀動(dòng)脈支架植入術(shù)成為冠心病(CHD)治療中一種有確切療效的重要手段，但相當(dāng)高(10％～50％)的支架內(nèi)再狹窄(ISR)率限制了支架植入術(shù)的發(fā)展。隨著可在局部緩慢釋放抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖藥物的藥物涂層支架(DES)的應(yīng)用，ISR率明顯降低，大大延緩了支架術(shù)后再次行PCI的時(shí)間。目前，臨床常用的有雷帕霉素涂層支架和

2、紫杉醇涂層支架。但藥物涂層支架的使用也面臨許多問題。如支架運(yùn)用的遠(yuǎn)期療效，以及昂貴的價(jià)格等。因此，有必要尋求一種療效較好，價(jià)格合適的藥物涂層支架。從支架洗脫藥物的角度來說，葛根素具有以下優(yōu)勢(shì)：(1)為異黃酮，具有脂溶性，能在組織中長(zhǎng)期存留；(2)抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖，促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞凋亡；(3)促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞修復(fù)；(4)抗炎作用；(5)抑制血小板聚集。以上特點(diǎn)表明，葛根素具有防治支架術(shù)后再狹窄的可能性。所以采用中藥葛根素涂層支架進(jìn)行動(dòng)

3、物實(shí)驗(yàn)，并與裸支架、PC涂層支架以及臨床應(yīng)用的國(guó)產(chǎn)雷帕霉素涂層支架(Firebird)進(jìn)行比較，觀察葛根素對(duì)家兔髂動(dòng)脈支架植入術(shù)后再狹窄的療效，探討葛根素藥物涂層支架能否有效抑制內(nèi)膜增生，能否抑制支架內(nèi)再狹窄的發(fā)生；并進(jìn)一步通過體外實(shí)驗(yàn)考察葛根素能否有效保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞，抑制炎癥反應(yīng)，從而在早期阻斷再狹窄的發(fā)生和發(fā)展，并初步探討其作用機(jī)制。 本實(shí)驗(yàn)分為三個(gè)部分： 1.葛根素對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)炎性損傷后修復(fù)保

4、護(hù)作用研究 方法：(1)HUVEC的分離培養(yǎng)及鑒定；(2)噻唑藍(lán)(MTT)比色法測(cè)定葛根素對(duì)體外培養(yǎng)的白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)損傷后HUVEC增殖和活性的影響；(3)硝酸還原酶法測(cè)定葛根素對(duì)IL-1β?lián)p傷后HUVEC分泌一氧化氮(NO)的影響；(4)放免法測(cè)定葛根素對(duì)IL-1β?lián)p傷后HUVEC分泌內(nèi)皮素-1(ET-1)影響；結(jié)果：高、中、低三劑量組葛根素均能保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞，提高HUVEC活性。其中葛根素濃度10<'-3>mo

5、l·L<'-1>時(shí)，能明顯提高內(nèi)皮細(xì)胞活性； IL-1β可使細(xì)胞培養(yǎng)上清液中NO含量減少，ET-1含量升高，與正常對(duì)照組比較有顯著性差異。葛根素高、中、低三劑量組均可使NO含量增加，與模型組比較有顯著性差異。其中，葛根素高、中劑量組可使ET-1含量降低，與模型組比較有顯著性差異。但葛根素低劑量組降低ET-1含量作用不明顯，與模型組比較，無差異性。 2.葛根素對(duì)炎性損傷后HUVEC的細(xì)胞因子表達(dá)及炎性細(xì)胞黏附遷移的影響 方

6、法:(1)采用ELISA法檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液上清中的單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)，白細(xì)胞介素-6(IL-6)，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)，E-選擇素(E-slectin)的含量；(2)采用黏附實(shí)驗(yàn)的方法檢測(cè)葛根素對(duì)HUVEC和U937單核細(xì)胞黏附的影響；(3)采用Transwell法，檢測(cè)葛根素對(duì)U937單核細(xì)胞遷移的影響；(4)采用Westemblot分析葛根素對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子NF-кBP65活化以及對(duì)P-IкBα的影響

7、。結(jié)果：細(xì)胞ELISA法觀察到：IL-1β刺激下，HuVEC的粘附分子E-selectin、趨化因子MCP-1、炎癥因子IL-6、TNF-α的表達(dá)量增高。葛根素能降低炎性損傷后HUVEC的E-selectin、MCP-1、IL-6、TNF-α表達(dá)量；黏附實(shí)驗(yàn)證實(shí)，IL-1β刺激下，HUVEC與U937單核細(xì)胞的黏附增強(qiáng)，葛根素能抑制HUEVC與L1937單核細(xì)胞的黏附；趨化遷移實(shí)驗(yàn)證實(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)IL-1β作用后對(duì)U937單核細(xì)胞趨化作

8、用增強(qiáng)，而加入葛根素后，可減少U937細(xì)胞的遷移數(shù)目；Westen blot實(shí)驗(yàn)顯示：IL-1β刺激HUVEC，誘導(dǎo)IкBα磷酸化，提高NF-кB活性，葛根素能抑制IкBα磷酸化，阻止內(nèi)皮細(xì)胞NF-кB的活化過程。 3.家兔髂動(dòng)脈支架植入術(shù)觀察葛根素涂層支架的療效 方法：行家兔髂動(dòng)脈支架植入術(shù)，四周后處死，取支架植入處血管切片。前期實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)，葛根素能抑制家兔髂動(dòng)脈新生內(nèi)膜的增生，并且免疫組化也顯示，葛根素能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)

9、胞內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)表達(dá)增多，降低炎性因子IL-6表達(dá)。在此基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化法進(jìn)一步觀察組織中NF-кBP65，MCP-1蛋白表達(dá)情況。結(jié)論：支架內(nèi)再狹窄的形成機(jī)制復(fù)雜，炎癥反應(yīng)作為一個(gè)復(fù)雜的互相影響的網(wǎng)絡(luò)式反應(yīng)，是支架術(shù)后再狹窄發(fā)展過程中的重要因素。 通過以上三部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)： 1. 葛根素對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷有保護(hù)作用，并能調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞活性物質(zhì)的分泌，保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的功能。 2. 葛根素通