K562細胞中hsa-miR-30e靶向BCR-ABL融合基因的初步研究.pdf

1、慢性髓性白血病(Chronic myelogenous leukemia,CML)是我國最常見的一種慢性白血病,主要見于20歲以上的成年人,尤其以壯年居多。盡管CMI.在慢性期發(fā)展緩慢,自然病程可持續(xù)5-6年,但是若病情演變則會進入加速期或直接進入急變期。CML一旦發(fā)生急性變,患者的存活時間往往只有3-6個月。目前唯一能根治CML的方法是異基因造血干細胞移植,但由于供者來源有限、醫(yī)療費用高等因素最終只有不到20％的患者能夠進行干細胞移植

2、治療。CML最重要的細胞遺傳學特征是存在特異性的Ph染色體(Philadelphia Chromosome),95％的CML細胞中會存在Ph染色體。Ph染色體是由第9號染色體長臂遠端的ABL基因(9q34)和第22號染色體長臂上的BCR基因(22q11)相融合形成BCR-ABL融合基因。CML中表達增強的融合基因BCR-ABL編碼一種新的融合蛋白P210BCR-ABL。該融合蛋白具有很強的ABL酪氨酸蛋白激酶(protein tyros

3、ine kinase,PTK)的活性,能通過激活一些具有促進細胞分裂的蛋白及一些抑制細胞凋亡的蛋白而促進細胞分化,對白血病的發(fā)生發(fā)展起著重要的作用。近年來隨著對CML分子發(fā)病機制研究的不斷深入,逐漸形成了針對BCR-ABL融合基因及P210融合蛋白的特異分子靶向治療的新思路,有助于在治療CML中尋找非移植的根治方法。
　　 MicroRNAs(miRNAs)是一類長約23個核苷酸(nt)的內源性的、非編碼的單鏈RNA分子,它們廣

4、泛存在于從植物、線蟲到人類的細胞中。迄今為止,在動植物中已經發(fā)現了數以千個miRNA基因,目前認為在不同物種中,編碼miRNA的基因約占蛋白編碼基因的1％左右,它們通過與所靶向基因的mRNA的3’UTR區(qū)互補結合,實現對靶向mRNA進行切割或者轉錄后抑制,進而作為一類重要的調控分子,參與對生物體的生長、發(fā)育、衰老和死亡的調控。在正常生理狀態(tài)下,生物體內的miRNAs表達呈嚴格的組織及發(fā)育階段特異性,如果miRNAs的表達發(fā)生失調,則可能

5、會引起各種疾病的發(fā)生發(fā)展。目前研究人員已經證明miRNAs在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。已經有研究表明,miR-203在CML及部分ALL(acute lymphoblastic leukemia)中通過遺傳學和表觀遺傳學機制導致其在轉錄水平的沉默,并且導致了其可能的靶基因ABL和BCR-ABL在這些特定血液系統(tǒng)腫瘤中被激活,BCR-ABL融合蛋白表達增加。而再表達miR-203則可減少ABL,蛋白及BCR-ABL融合蛋白的表達

6、,并能抑制腫瘤細胞增殖,這為某些血液系統(tǒng)腫瘤的臨床治療提供了新的思路。
　　 本課題基于當前對CML及miRNAs深入研究的基礎之上,探討在CML中是否存在靶向BCR-ABL融合基因的其他miRNAs,并初步篩選鑒定這些miRNAs與融合基因BCR-ABL之間的靶向關系,為進一步研究在CML的發(fā)生發(fā)展過程中某種或多種miRNAs如何發(fā)揮調節(jié)機制奠定基礎,也期望能通過本課題的研究為臨床上對CML進行的干預治療提供一定思路。

7、　　 本課題首先利用三種不同的生物信息學軟件對可能靶向BCR-ABL融合基因的miRNAs進行篩選,然后交集三種預測軟件得到的結果,以犧牲預測軟件的敏感性而提高預測結果的特異性的方法獲取三種預測軟件共有的預測結果。然后挑選其中的一個miRNA,并構建特異性表達該miRNA的慢病毒質粒。利用包裝細胞對慢病毒質粒進行包裝并獲取慢病毒上清。以CML的細胞株K562細胞為研究對象,慢病毒上清感染K562細胞,然后通過實時熒光RT-PCT及We

8、stern-blot的方法檢測感染后K562細胞的miRNA表達及融合蛋白的表達情況,并初步判斷所研究miRNAs與BCR-ABL融合基因是否存在靶向關系。
　　 本論文主要包括以下三部分內容:
　　 第一部分:靶向BCR-ABL融合基因的microRNAs的篩選
　　 首先利用TargetScan、Miranda和PicTar三種不同的生物信息學軟件對可能靶向BCR-ABL基因的miRNAs進行預測,分別得到了

9、35種、12種和9種miRNAs。然后將這種三種預測軟件的結果取交集,得到了miR-30家族(包括miR-30a/30b/30c/30d/30e)為三種軟件的共同預測結果。同時根據PicTar’對miR-30家族成員的排序得分進行分析,認為在該家族中,hsa-miR-30e排序得分更高,相比其他家族成員,更有可能靶向融合基因BCR-ABL。故而本研究選擇hsa-miR-30e作為進一步研究對象,探討其與BCR-ABL融合基因之間是否存在

10、靶向關系。
　　 第二部分:hsa-miR-30e基因的克隆及慢病毒表達載體的構建
　　 首先提取正常人全血中的基因組DNA；從NCBI中查找到hsa-miR-30e的初始序列,選取包含hsa-miR-30e成熟序列及其兩端各約200個堿基的序列,并根據這段序列設計合成引物；以提取的正?；蚪MDNA為模板,進行PCR擴增miR-30e基因片段；將擴增的miR-30e目的片段與T載體相連構建pMD-18T-miR30e重組

11、質粒,將其轉化到感受態(tài)E.coli DH5α菌中,并通過藍白斑篩選挑取陽性克??；對陽性克隆進行菌液PCR,抽提質粒后酶切鑒定及測序鑒定,將鑒定正確的陽性克隆擴大培養(yǎng),提取質粒；對慢病毒載體系統(tǒng)的三套質粒(包括慢病毒質粒pLL3.7、包裝質粒pCMV-dR8.91及衣殼蛋白質粒pCMV-VSVG)轉化入感受態(tài)E.coli STBL3菌中,經酶切鑒定后擴大培養(yǎng)并提取質粒；利用限制性內切酶Xho Ⅰ和Hpa Ⅰ分別對pMD-18T-miR30

12、e重組質粒和慢病毒質粒pLL3.7進行雙酶切并進行瓊脂糖凝膠電泳回收純化目的片段；利用T4 DNA連接酶對上述兩種酶切質粒的回收片段進行連接,構建pLL3.7-miR30e重組質粒,并將連接產物轉化感受態(tài)E.coli STBL3菌中,抗生素篩選陽性克隆,進行菌液PCR鑒定,并抽提質粒進行雙酶切、測序鑒定；將鑒定正確的pLL3.7-miR30e陽性克隆進行擴大培養(yǎng),連同pCMV-dR8.91和VSVG質粒的轉化菌,利用高純度質粒提取試劑盒

13、提取三種質粒備用。
　　 第三部分:pLL3.7-miR30e慢病毒的獲取及K562細胞中miR-30e與融合基因BCR-ABL靶向關系的初步鑒定
　　 使用含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)包裝細胞293FT細胞,轉染前一天在10cm細胞培養(yǎng)皿中鋪1×106個293FT細胞:將提取的高純度質粒pLL3.7-miR30e、dR8.91和VSVG按照質量比為20:15:10的比例混合(總質量為24μg),按質粒DNA混合

14、液與脂質體2000比例為1:2.5的比例取60μl脂質體,并用無血清DMEM培養(yǎng)基制備轉染復合物；轉染復合物轉染293FT細胞48小時后倒置熒光顯微鏡下觀察,并收集慢病毒上清并過濾、分裝；梯度稀釋慢病毒上清,感染293FT細胞,48小時后倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白(GFP)表達情況,并計數表達GFP陽性細胞數,根據公式計算慢病毒上清滴度約為1×106TU/ml。以U6 snRNA作為內參照物,利用購買的miRNA套裝引物,應用實時

15、熒光定量RT-PCR相對定量的方法檢測感染前后293FT細胞中miR-30e表達情況,實驗結果表明感染后293FT細胞中miR-30e表達約為感染前293FT細胞26倍；慢病毒上清感染K562細胞,并應用實時熒光定量RT-PCR和Western-blot方法檢測感染前后K562細胞中miR-30e及BCR-ABL融合蛋白的表達情況。
　　 綜上所述,本研究通過生物信息學軟件預測了可能靶向融合基因BCR-ABL的miRNAs,篩選

16、到了miR-30家族,并挑選hsa-miR-30e作為進一步研究對象；正確克隆了表達hsa-miR-30e的基因片段:成功構建了pLL3.7-miR30e重組質粒；并通過包裝獲取了慢病毒上清,計算其滴度約為1×106 TU/ml；利用所獲得的慢病毒上清感染K562細胞,并利用實時熒光定量RT-PCR及Western-blot技術對感染后K562細胞中hsa-miR-30e表達及BCR-ABL融合蛋白表達情況進行了檢測。雖然由于所獲得的慢