pdt對反義bcr-abl寡核苷酸k562細(xì)胞轉(zhuǎn)染的影響

1、《 激光雜志》 2 0 o 4 年第 2 5 卷第 2期 L A S E RJ O U R N A L ( V o 1 ． 2 5 ． N o ． 2 ． 2 0 0 4 )7 3· 激光醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué) ·P D T對反義 b c r —a b l 寡核苷酸 k 5 6 2細(xì)胞轉(zhuǎn)染的影響 張 林， 虞樂華， 吳南順， 許f f j 山( 第三軍 醫(yī)大 學(xué)， 重慶 4 0 0 0 3 7 )提要 ： 目的 ： 體外研 究光

2、動(dòng)力治療 ( P D T ) ~ , j - b 3 a 2 型反義 b c — a b l 寡核苷 酸( A S O ) 慢性髓 細(xì)胞性 白血病 ( C M L ) 細(xì)胞株 K 5 6 2 轉(zhuǎn)染 的影響 ， 為P D T 合并反義技術(shù)噓用于 C M L患 者治 療提 供實(shí) 驗(yàn) 基礎(chǔ) 方法 ： 半 導(dǎo)體激 光 ， 波 長 6 5 0 n m ， 劑 量 9 J ／ c垂 直照 射 光敏 劑 為血 卟啉 單 甲醚 ( H M M E )

3、， 采用體外細(xì)胞培養(yǎng) 技術(shù) ， 流式細(xì)胞儀檢測 P D T 實(shí)驗(yàn)組 與 對照組熒光標(biāo)記的反 義 b c — a b l 寡核苷 酸( A s P 0 ) K 5 6 2 細(xì)胞攝人率 及熒光強(qiáng) 度。結(jié) 果 ： ①P D T可顯著提高 k 5 6 2 細(xì)胞對反義 h e r —a b l 寡核苷酸的攝 人 ， 比直接轉(zhuǎn)染增 加轉(zhuǎn)染率可 達(dá) 4 —1 0 倍 。且 k 5 6 2細(xì)胞對 反義 b c r —a b l寡核苷酸的攝 入和反義 b

4、 c r — a b l 寡核苷 酸濃度及作用時(shí)間有關(guān) 一②光敏劑量濃度為 09 , u m o l · 1時(shí)轉(zhuǎn)染的效率最高 ， 4 小時(shí)點(diǎn)細(xì)胞 內(nèi)平均熒光 強(qiáng)度最強(qiáng)( P 9 5 ％的細(xì)胞 用 于實(shí)驗(yàn)，光敏 劑血 卟啉單 甲醚 ( H M M E )半導(dǎo)體激 光 ， 波 長為 6 5 0 n m 合成 與 b c r —a b lm R N A融合 點(diǎn)兩側(cè)各 9個(gè)核苷酸 互補(bǔ)的未修飾 反 義寡核苷 酸 (P 0一O N D

5、) ， 兩 端部分硫代修飾 反義序列 為： 5 ’ 一 《丸 A (r r r r (A A (一 3 ’ ． 部 分 A s p o 的 5 。 端進(jìn)jF A M熒光素標(biāo)記 ， 標(biāo)記效率采用紫外分光光度法 分析 ， O D - , ~ , 0 ／ O l： 2 ～ 6 表明標(biāo) 記完傘 2方法 2I 實(shí)驗(yàn) 分 組 分 為2組 ： P l Y l ’ 實(shí)驗(yàn)組和對照組 其中實(shí)驗(yàn) 組加入 同濃度 的熒 光標(biāo) 記 A S P Oj 光敏荊后 ，

6、 激 光照射 一時(shí)照組只加入等量的熒光標(biāo) 記的反 義 寡核仟酸 ，加光敏劑 ， 小給 于激 光照射 ， 其他 實(shí)驗(yàn)條件 和處 理組 相同 22K 5 6 2 細(xì)胞與熒光標(biāo)記的 A s p o 及 t - ~ I M E 共培養(yǎng) 23 體外激光光照處理 將 I 述細(xì)胞 從孵箱 中墩 出， 于暗事用 半導(dǎo)體激 光 ( 跆光斑 3 c r n 處 輸 出功率 1、 x ， 劑 鱧9 J ／ c m 2 ) 垂直照 射培養(yǎng)孔 3 o 分鐘 ，

7、后繼續(xù)將細(xì)胞 置于 3 7． 5 ％C O , 、 飽和濕度孵箱 中孵 育 同時(shí)間 維普資訊 http://www.cqvip.com 7 4《 激光雜志) 2 o 0 4 年第 2 5 卷第 2 期 L A S E RJ O U R N A L ( V o 1 ． 2 5 ． N o ． 2 ． 2 O O 4 )2 ． 4 熒光標(biāo)記 A s p o 的細(xì)胞攝入 取處理后 不同觀察時(shí)相點(diǎn)細(xì)胞 ， P B S 沖洗 5 次后熒光顯微鏡

8、下觀 察無游離熒光 ， 流式細(xì)胞儀 ( B i o — R a d 。 U S A ) 檢測 A s p o 的細(xì)胞攝 入率 及胞 內(nèi)平均熒光強(qiáng)度。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 ： 所有數(shù)據(jù) 以 x ±s 表示 。 樣本均 數(shù)采 用 S P S S 1 0 ． 0 軟件 包 進(jìn)行單因 素方差分析 3結(jié)果 激光劑量 9 J ／ e r a 2 光敏劑濃度 為 2 0 t ~ g ／ m l 、 在 不同 的觀察時(shí)相 點(diǎn)圉 ． 16 小 時(shí) 觀 察

9、 點(diǎn) 各 組 熒 光 標(biāo) 記 的 A S P 0 的 K 5 6 2 細(xì)胞 攝 入 率1 為A S P 0濃度為0 ． 1 5 u m o l · L - - ： 2 為A S P 0 。濃度為0 ． 3 u m o l · L ～ ； 3 為’ A S P 0濃度為0 ． 6 u m o 1 ． I； 4 為A S P 0濃度為0 ． 9 u m o l · 1一 1 ． ( 余圖均同) ，( 6 h 、

10、 1 2 h 、 1 8 h 、 2 4 h ) 觀察 P D T實(shí)驗(yàn)組 和對照組 的熒 光標(biāo)記 的 ^ S P O 的k 5 6 2 細(xì)胞攝入率變化 圖 I 一 4 一 與同組對照組 比較 ， P < 0 ． 0 1 ；： 與同組對 照組 比較 ， P < 0 ． 0 5②激光劑量 為9 J ／ e m 2 ， 光敏 劑濃度 為 2 o t ~ , ／ ~ 熒 光標(biāo) 記的 A S P O為 0 ． 9 ~ u n o l

11、 · L濃 度組 時(shí)， 轉(zhuǎn) 染 的效率 最高 ， 作用 4 小 時(shí)左右細(xì) 胞 內(nèi)平均熒 光強(qiáng)度最強(qiáng)( P <0 ． O 1 ) ． 且細(xì) 胞 內(nèi)平均 熒光強(qiáng)度 隨 A S P O濃 度 的增加 而增高 ( 圖 5 —6 )但 直接轉(zhuǎn)染 時(shí) ， 6小時(shí) 才達(dá) 到 高峰 ， 且 當(dāng)A S P o的濃度為 0 ． 6 ／ a n o l · L ～ ～ 0 ． 9 ~ r n o l · L時(shí) ， K 5

12、6 2 細(xì)胞對 熒光物質(zhì) 的攝人 即達(dá)到飽和( 圖 5 —6 )圖 42 4小時(shí)觀察點(diǎn)各組熒光標(biāo)記 的 A S P O的 K 5 6 2細(xì)胞攝人率 4討 論 甚 雕裝氍囂掃 卜圖 5不 同作用時(shí)間對熒光標(biāo) 的 A S P O 包 內(nèi)平 均 熒 光 強(qiáng) 度 ( F ) 影 響 眾多研究表明， 反義 b c r — a b l 寡核苷 酸能抑制 C M LF { 血病細(xì)胞 的增殖以及促進(jìn)其凋亡 的作用 。現(xiàn)階段人工合成 的反義寡核苷

13、酸的細(xì)胞攝入率偏 低， 易被胞 內(nèi)核酸酶降解 ， 難 以高效到 達(dá)核 內(nèi)發(fā)揮其抑 制作用等問題 ， 促使國內(nèi)外 學(xué)者們?nèi)?尋找更 加有效 的反 艾核酸的 胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)體系 基于 P i l l 、 的光化學(xué)基因轉(zhuǎn)染 法 ， 是 近年來發(fā)展起 來 的一種新 的基陰細(xì)胞 轉(zhuǎn)染法主要原理為 當(dāng)光敏劑和待轉(zhuǎn)染基 因及細(xì)胞共 同孵 育一段 時(shí)間后 ， 待轉(zhuǎn)染基 因就會(huì)伴隨光敏劑被細(xì)胞 內(nèi)吞 噬 ， 形成光敏 劑和待轉(zhuǎn) 染基 因共存 的內(nèi)吞 噬小泡 ，

14、內(nèi)吞噬小 泡在胞 漿 內(nèi)運(yùn) 動(dòng) ， 部分到達(dá)核 膜在適 當(dāng)波長的光照下 ， 光敏劑受激發(fā)引 發(fā)光化學(xué)反應(yīng) ．產(chǎn) 單線 態(tài)氧， 從而引起 內(nèi)吞噬小泡的破 裂 ， 釋放其 內(nèi)含的待轉(zhuǎn)染基 因于胞漿 內(nèi)或 核膜 內(nèi)。從 而實(shí)現(xiàn) 了待轉(zhuǎn) 染 基因的 胞漿 內(nèi)或核 內(nèi)轉(zhuǎn) 移 P r ' a ． ~ u c k a i t e 等研究證實(shí) ， 依 據(jù)這種 非病 毒載體 的光 化學(xué)基 因轉(zhuǎn) 染沿1 J 以增加摹因 的細(xì)胞轉(zhuǎn)染率達(dá) l O 一

15、2 o 倍 ， 一砦實(shí)驗(yàn) 誑實(shí)基 因的細(xì)胞轉(zhuǎn) 染增加 可達(dá) 1 0 0 倍 。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在 不用陽離 子脂 質(zhì)體 預(yù)構(gòu)建 轉(zhuǎn)運(yùn) 復(fù)合體 的情況下 ， 光化學(xué)基 因轉(zhuǎn)染 可以增加基 因的 細(xì)胞轉(zhuǎn) 染率 達(dá) 4 一l O 倍 ， 而且細(xì)胞在 3 — 4 h 對 藥物的 吸收 即可達(dá) 到高峰 ， 同 時(shí)反義寡核 苷酸在細(xì)胞內(nèi)的停 留時(shí) 間明顯延 長、表明光化學(xué)基 因轉(zhuǎn) 染法一 方面加快 r 細(xì)胞對反義寡核 苷酸的細(xì)胞 攝人 ， 另一方 面增加

16、 r 胞 內(nèi)反義寡核 苷酸的積聚濃度和停 留時(shí)間 一這將有助 于反 義寡核 苷酸 更加有效地發(fā)揮 其生物 活性 S m e ~ e r s 等研 究認(rèn)為 反 義寡核苷酸 直接轉(zhuǎn)染細(xì)胞時(shí) ， 反 義 寡核苷 酸的吸收 直接依賴于細(xì)胞外濃度 ， 且在 1 8d ' d l ' j 內(nèi)細(xì)胞的攝八基本是恒定的 ， 此后攝入率開始下降 本研 究 觀察劃反 義 b e r— a b l 寡核苷酸 直接轉(zhuǎn) 染 k 5 6 2 細(xì)胞

17、時(shí)也 觀察 到· l 8d , u , J 內(nèi) 直接 轉(zhuǎn)染 對照組的攝 入率變 化 小大， 此 后攝 入率 開始下 降從數(shù)值 看撮 人率相 對光化學(xué)基 因轉(zhuǎn)染組 叫顯偏 低 ， 差 譯瞳著 說明 光化學(xué)基因轉(zhuǎn)染組 相對直接轉(zhuǎn) 染對照組 娃著提高 r 反 義 b c r — a b l2 O盞 l 6蠢 1 2露 牛 1 O2哪 ! ． 1 2 ‘6不 同熒光標(biāo)記 的 A S P O濃度對 胞 內(nèi)平均熒光強(qiáng)度( F ) 影響

18、 寡 核 侍酸 k 5 6 2 細(xì) 胞 的 轉(zhuǎn) 染 綜 J聽述 ， 本研究初 步觀察 r 存 不同 陽離子脂質(zhì)體 預(yù)構(gòu)建轉(zhuǎn) 運(yùn) 復(fù)合體的情況下的光化學(xué)基 因轉(zhuǎn)染 對反 義 b c r — a b l 寡核苷酸轉(zhuǎn) 染的 影響 將 為 P D T合并反 義技 術(shù)應(yīng)用 于 C M L患 者以及體 外骨髓凈 化 提供基礎(chǔ)研究 參 考 文 獻(xiàn) l lP r a s n f i e k a i t eI， H o g s e t， B e r gK

19、 ． E v a l u a t i o no fd i f e r e n tp h o t o s e n ~ t i ·zf o ri L q ei np h o t o c h e m i c a lg e n et m n s f e c f i o n ( J ：P h o t o ch e mP h o t o b i ．0 I ． 2 o 0l ， 7 3： 3 8 8—3 9 5．L 2JWa n gH ，

20、P r a s a dG． B u o l a m w i n iJk， e la 1 ． ． ~ m t i s e n s ea n f i c a n e e ro l i g o n u -e l e x ~ t i d et h e r a p e u t i c s 【 J jC u r tC a n ( ~ rD r u gT a r g e t s ， 2 0 0 1 ， l ( 3 ) ： l 7 7—9 6【 3 j

21、K i n d l e rⅥ e v e rRG， F i s c h e rr ． B C R —A B Ia t a r ge t f o rh o v e l t h e r ．a(chǎn) t ~ a i ei n t e r v e n t i o n s } JE x p e r to r ) j n1 1 1 e rF a r g e t ~ ． 2 0 O 2 ， 6( 1 ) ： 8 5一l O 1l 4F i n g a rV

22、 H． K i kP K， H a y d o nP s ， e la 1 ． A n a l y s i so f a c u t ev a ． ~ u l a l “ d a r n aa f t e rp h o t o d y n a m kt h e r a p yu s i n gb tz 叩 o r p h y n nd e r i v a t i v e ( B P D ) [ J 、 ．B r —J 一 “ C a n

23、 c e r ， 1 9 9 9 ， 7 9 ( 1 1 ) ： l 7 o 2 ．5 jE nr e c h tB， We n o nC． Ka c h u rv 1e ta lP h o t o f r i n— me d i a t e dp h o t o ．d V n a n u ( 。 t he r a p yi n d u c e dv a ． ~u l a ro cc l u s i o na n da p o p t

24、o s i si nah u ma n’ | n ax e n o g r a f im o d e l 【 JC a n c e rR e s ． ， 1 9 9 9 ， 5 9 ( 1 7 ) ： 4 3 3 4— 4 M2【 6 ，H ( ’ 州 ， P r a s m ie k a i t et， T j e l l eTE， e ta lP h ~ ~ o ch e r m c a lt r a n s f e c f i

25、o n ，ant n‘ h n o l o g yf i l l “ l i g h ~ 一 i n d u c e x t ． s i t e—d i r e c t e dg e n ed e l i v e r y． f JHu mG e n eI h e r ． 2 0 0 o， 】 】 ： 8 6 9—8 8 0e 7P r , ~ m i e k a i t el ， H ~' s e t^ ． B e r gher