HIF-1抑制惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞分化機(jī)制研究及KIAA0280基因敲除模型建立.pdf

1、膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)性腫瘤。目前，對于惡性和復(fù)發(fā)的膠質(zhì)瘤患者仍沒有有效的治療手段，患者的預(yù)后并不樂觀。分化障礙是惡性腫瘤細(xì)胞的基本生物學(xué)特征，而誘導(dǎo)分化是指惡性腫瘤細(xì)胞在誘導(dǎo)分化劑的作用下，重新進(jìn)入分化程序，向正常成熟細(xì)胞方向逆轉(zhuǎn)的現(xiàn)象，同時誘導(dǎo)分化劑對正常細(xì)胞不產(chǎn)生毒副反應(yīng)。尋找高效低毒的誘導(dǎo)分化劑是這一策略的核心。
　　 實體瘤的發(fā)生發(fā)展過程中伴隨缺氧的發(fā)生。腫瘤內(nèi)部缺氧的發(fā)生與其高惡性程度，放化療不敏感性和預(yù)后

2、不良有密切關(guān)系。但是，缺氧對于分化治療的影響報道不多，機(jī)制研究尚不深入。缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factor)是細(xì)胞缺氧反應(yīng)中最重要的轉(zhuǎn)錄因子，在惡性腫瘤細(xì)胞HIF-1與其高惡性度有正相關(guān)性。
　　 Forskolin(forskolin)是已知的腺苷酸環(huán)化酶(adenyl cyclase)激動劑，迅速提高細(xì)胞內(nèi)環(huán)腺苷酸(cAMP)水平。cAMP具有抑制細(xì)胞增殖和促進(jìn)分化的作用。從不同途徑上調(diào)cAMP，

3、均可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其分化和凋亡。Forskolin可誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的大鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞分化。
　　 本章通過觀察化學(xué)性缺氧誘導(dǎo)物氯化鈷(cobalt chloride)和去鐵胺(deferoxamine，DFO)林誘導(dǎo)大鼠C6膠質(zhì)瘤分化的影響，探索缺氧誘導(dǎo)因子在分化治療中的作用，為臨床有效治療惡性膠質(zhì)瘤提供新的思路。
　　 第一章 Foskolin對惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞分化的作用
　　 方法：大鼠C6細(xì)胞株培養(yǎng)

4、；相差顯微鏡(phase contrast microscopy)及透射電鏡(transmission electron microscopy)觀察Forskolin作用前后的形態(tài)及細(xì)胞內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)；Western blotting蛋白免疫印跡法分別檢測膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acid protein，GFAP)、增殖細(xì)胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen，PCNA)

5、蛋白水平；免疫組化(immunohistochemistry)染色方法檢測GFAP表達(dá)；甲基偶氮唑藍(lán)比色(3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide，MTT)法測定細(xì)胞增殖能力；Hoechst33258染色觀察核及染色質(zhì)的形態(tài)變化；乳酸脫氫酶(lactatedehydrogenase，LDH)漏出率檢測測定細(xì)胞存活率(viability)；流式細(xì)胞儀(flo

6、wcytometry)檢測細(xì)胞周期(cell cycle)；定量實驗結(jié)果以x±s表示，采用t檢驗和方差分析。
　　 結(jié)果：Forskolin引起大鼠C6細(xì)胞形態(tài)學(xué)及超微結(jié)構(gòu)改變、GFAP表達(dá)增加、PCNA表達(dá)降低，細(xì)胞增殖抑制，G1期阻滯、S期細(xì)胞減少。同時不發(fā)生細(xì)胞凋亡和死亡。
　　 結(jié)論：Forskolin可誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞分化。
　　 第二章氯化鈷和去鐵胺對HIF-1蛋白水平的影響
　　 方法：大鼠C

7、6細(xì)胞株培養(yǎng)；相差顯微鏡術(shù)觀察氯化鈷和去鐵胺處理細(xì)胞前后形態(tài)變化；MTT法測定細(xì)胞增殖能力；Hoechst33258染色觀察核及染色質(zhì)的形態(tài)變化；乳酸脫氫酶漏出率檢測測定細(xì)胞存活率(viability)；Western blotting蛋白免疫印跡法檢測HIF-1α白水平。
　　 結(jié)果：氯化鈷和去鐵胺均可升高C6細(xì)胞HIF-1蛋白水平。高劑量氯化鈷或去鐵胺都具有明顯的細(xì)胞毒性，但是在100μM24小時內(nèi)沒有顯著的細(xì)胞毒性，對細(xì)胞

8、增殖沒有顯著的抑制作用。
　　 結(jié)論：在控制的劑量下和處理時間內(nèi)，氯化鉆和去鐵胺可以作為化學(xué)缺氧劑用于腫瘤誘導(dǎo)分化試驗的。
　　 第三章缺氧抑制Forskolin誘導(dǎo)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞分化
　　 方法：大鼠C6細(xì)胞株培養(yǎng)；相差顯微鏡術(shù)觀察細(xì)胞胞體及突起形態(tài)；Western blotting蛋白免疫印跡法分別檢測GFAP、PCNA蛋白水平；流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。
　　 結(jié)果：氯化鈷和去鐵胺可抑制Forskoli

9、n誘導(dǎo)的C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞分化，抑制GFAP蛋白表達(dá)劑及形態(tài)改變，但是對于forskolin的增殖抑制作用沒有抑制。
　　 結(jié)論：缺氧可抑制forskolin誘導(dǎo)的大鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞分化，使得細(xì)胞處于周期捕獲，分化停滯的狀態(tài)。
　　 第四章缺氧抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞分化的機(jī)制研究
　　 方法：大鼠C6細(xì)胞株培養(yǎng)；相差顯微鏡術(shù)觀察細(xì)胞胞體及突起形態(tài)；siHIF-1α轉(zhuǎn)染細(xì)胞并檢測轉(zhuǎn)染率；siVHL轉(zhuǎn)染細(xì)胞并檢測轉(zhuǎn)染率；chet

10、omin預(yù)處理細(xì)胞后觀察氯化鈷對分化的抑制作用；蛋白免疫印跡法分別檢測HIF-1α、pVHL、GFAP蛋白水平；結(jié)果：pVHL干擾可取消Forskolin誘導(dǎo)的C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞分化，相反，HIF-1α干擾可取消氯化鈷對forskolin誘導(dǎo)分化的抑制作用，用chentomin阻斷HIF-1的轉(zhuǎn)錄激活活性后，氯化鈷的抑制作用被取消。
　　 結(jié)論：缺氧抑制forskolin誘導(dǎo)的大鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞分化的過程中，HIF-1α蛋白水平的上

11、調(diào)具有關(guān)鍵性的作用。
　　 第五章 GSK-3β在膠質(zhì)瘤細(xì)胞分化中的機(jī)制研究
　　 方法：大鼠C6細(xì)胞株培養(yǎng)：相差顯微鏡術(shù)觀察細(xì)胞胞體及突起形態(tài)；siGSK-3β、GSK-3β-S9A轉(zhuǎn)染細(xì)胞并檢測轉(zhuǎn)染率；蛋白免疫印跡法分別檢測GSK-3β、GFAP蛋白水平；激光共聚焦觀察GSK-3β、cyclin D1亞細(xì)胞定位情況。
　　 結(jié)果：GSK-3β干擾可取消Cholera toxin誘導(dǎo)的C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞分化。GSK

12、-3β通過入核啟動cyclin D1出核調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)胞分化。
　　 結(jié)論：GSK-3β通過與cyclin D1相互作用調(diào)控惡性膠質(zhì)瘤分化。
　　 腦缺血性中風(fēng)是心腦血管病的主要病種，中國腦缺血總分的發(fā)生率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于歐美國家。腦卒中一旦發(fā)生，后果嚴(yán)重，病人非死即殘，嚴(yán)重威脅人類健康。全球每年新發(fā)1500萬例，其中500萬人死亡，500萬人永久性殘廢。要使幸存者恢復(fù)功能，耗時費力且療效差。因此，就腦卒中而言，防止其發(fā)生比治療

13、更重要。如何預(yù)防腦卒中的發(fā)生是目前醫(yī)學(xué)界的面臨的一大難題。目前除了降壓以外，其他有效治療措施不多。此外，對于缺血性腦卒中，降壓治療并不能完全阻止腦卒中的發(fā)生。因此，有必要對腦卒中的病理生理機(jī)制進(jìn)行深入的研究，找出除了血壓以外的其他決定因子或者預(yù)防措施，針對這些因子或措施進(jìn)行干預(yù)，作為預(yù)防腦卒中的新策略。雖然對于缺血性腦損傷的病理生理機(jī)制的研究不斷深入，相繼提出氧自由基，能量消耗、興奮性氨基酸毒性、鈣超載、細(xì)胞凋亡等學(xué)說，但是其機(jī)理尚未完

14、全清楚。我們的前期工作應(yīng)用大鼠腦中動脈栓塞模型(middle cerebral artery occlusion，MCAO)差異熒光顯示RT-PCR(FDD RT-PCR)技術(shù)篩選出腦缺血相關(guān)基因KIAA0280，并以獲得其敲除小鼠胚胎干細(xì)胞株。本研究采用小鼠囊胚腔顯微注射技術(shù)，構(gòu)建KIAA0280敲除小鼠，為該基因的功能研究奠定基礎(chǔ)。
　　 第一章選擇供體和受體小鼠及收集囊胚
　　 方法：性成熟前期小鼠促排、交配及孕檢

15、；囊胚收集和培養(yǎng)和觀察；輸精管結(jié)扎雄鼠的制備；受體雌鼠與結(jié)扎雄鼠交配及孕檢。
　　 結(jié)果：成功采集到活性良好的受精卵，體外培養(yǎng)出腔率高，易于纖維注射。結(jié)扎后雄鼠保留交配能力，可以用于準(zhǔn)備受體假孕雌鼠。
　　 第二章注射用胚胎干細(xì)胞的準(zhǔn)備
　　 方法：胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)與觀察；飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)及絲裂霉素C處理。
　　 結(jié)果：制備了良好的飼養(yǎng)層細(xì)胞，利于胚胎干細(xì)胞的生長，并抑制了其自身分化。胚胎干細(xì)胞生長良好，克

16、隆外周光滑，自身分化程度小。較好地保持了其全能性
　　 第三章囊胚腔纖維注射及嵌合體小鼠的鑒定
　　 方法：囊胚腔纖維注射；囊胚抑制；嵌合體小鼠毛色鑒定。
　　 結(jié)果：獲得活性良好的注射后的囊胚并成功移植到受體小鼠。獲得多只嵌合體小鼠。
　　 第四章雜合子小鼠的鑒定、回交
　　 方法：對嵌合體小鼠進(jìn)行回交；PCR鑒定雜合子小鼠；
　　 結(jié)果：PCR鑒定證實獲得種系嵌合體小鼠及雜合子一代小鼠