短發(fā)夾RNA沉默HIF-1α、hTERT基因抑制裸鼠皮下人腦膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：研究靶向低氧誘導(dǎo)因子-1 α(HIF-1 α)和人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)的短發(fā)夾RNA，對(duì)裸鼠人腦膠質(zhì)瘤中HIF-1 α、hTERT基因表達(dá)的抑制作用，以及影響裸鼠膠質(zhì)瘤的增殖并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，為腦膠質(zhì)瘤的基因治療提供新的依據(jù)。 方法： 1.根據(jù)低氧誘導(dǎo)因子-1 α和人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶的cDNA序列，構(gòu)建表達(dá)HIF-1 α mRNA、hTERT mRNA特異的短發(fā)夾RNA (shRNA) 真核表達(dá)質(zhì)粒pshR

2、NA。質(zhì)粒的大量提取，測(cè)序鑒定。 2.體外培養(yǎng)人腦膠質(zhì)瘤 U251 細(xì)胞株。 3.建立人腦膠質(zhì)瘤裸鼠皮下接種模型，通過腫瘤病理檢查及免疫組化GFAP(膠質(zhì)纖維酸性蛋白)表達(dá)，鑒定腫瘤符合膠質(zhì)源性特點(diǎn)。 4.治療組為HIF-1 α shRNA+hTERT shRNA組，并設(shè)對(duì)照組分別為HIF-1 α shRNA組、hTERT shRNA組、脂質(zhì)體包載的空質(zhì)粒組、PBS組。每組12只。 5.治療后每?jī)商鞙y(cè)各組

3、腫瘤體積，計(jì)算最終抑瘤率。 6．H-E染色觀察質(zhì)粒治療后移植瘤組織的病理改變。 7．Western免疫印跡法檢測(cè)HIF-1 α、hTERT蛋白的表達(dá)。 8．腫瘤細(xì)胞Annexin V+PI雙染流式細(xì)胞儀測(cè)凋亡。 結(jié)果： 1．成功建立穩(wěn)定的裸鼠人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251皮下移植瘤模型，免疫組化GFAP陽(yáng)性表達(dá)。 2．裸鼠皮下移植瘤模型中HIF-1αshRNA+hTERT shRNA組腫瘤增殖幅

4、度較空質(zhì)粒組和PBS組明顯減小(P<0.01)，治療3周后起較HIF-1αshRNA組和hTERT shRNA組亦減小(P<0.01)，其最終抑瘤率為84.2％。 3．病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，HIF-1αshRNA+hTERT shRNA組腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)受到明顯抑制，細(xì)胞散在稀疏，核分裂相少見，血管密度減少，微血管基本失去其基本形態(tài)，可見大量腫瘤細(xì)胞壞死及凋亡。 4．HIF-1αshRNA+hTERT shRNA組和HIF-1αs

5、hRNA組裸鼠移植瘤細(xì)胞內(nèi)HIF-1α蛋白表達(dá)OD值[(28.8±4.4)％、(27.6±4.1)％]與空質(zhì)粒組(96.5±6.9)％和PBS組(100％)相比差異顯著(P<0.01)；HIF-1αshRNA+hTERT shRNA組和hTERT shRNA組hTERT的蛋白表達(dá)OD值[(34.6±4.6)％、(35.3±4.8)％]與空質(zhì)粒組(97.4±6.7)％和PBS組(100％)相比差異顯著(P<0.01)。 5．流式細(xì)

6、胞儀檢測(cè)，HIF-1αshRNA+hTERT shRNA組腫瘤細(xì)胞的凋亡率(26.82±2.74)％明顯高于HIF-1αshRNA組和hTERT shRNA組[(10.78±1.20)％、(12.32±1.43)％](P<0.01)以及空質(zhì)粒和PBS組[(4.32+0.58)％、(2.28+0.26)％] (P<0.01)。 結(jié)論： 1．建立的U251裸鼠人腦膠質(zhì)瘤皮下移植瘤模型在組織病理學(xué)上符合人腦膠質(zhì)瘤特點(diǎn)，生長(zhǎng)穩(wěn)