原花青素交聯(lián)去細胞豬主動脈瓣——改進生物瓣處理方法的實驗研究.pdf

1、瓣膜置換術是治療各種心臟瓣膜疾病的唯一有效手段。目前臨床應用的人工瓣膜主要是機械瓣和生物瓣，其中生物瓣的應用越來越廣泛，在西方國家有的已超過機械瓣的用量。主要原因是機械瓣的終生抗凝治療及其抗凝并發(fā)癥導致的遠期效果與生物瓣沒有明顯差別。而生物瓣只需術后短期抗凝治療，且有較好的仿生血流動力學特點，術后并發(fā)癥較少。但是生物瓣鈣化、耐久性差的問題是不容忽視的。目前認為，生物瓣鈣化可能與瓣膜基質的丟失及戊二醛的作用，機械應力造成生物瓣損傷，宿主鈣

2、磷代謝影響，炎癥和免疫反應等因素有關。針對這一問題，國內外眾多實驗室都在尋求解決的方法，但結果均不理想。而在組織工程瓣膜的研究中，對生物原性的瓣膜材料進行去細胞處理后所獲得的去細胞瓣膜支架材料，由于去除了細胞成分，完整保存細胞外基質，具有較低的免疫原性和鈣化潛能，為瓣膜的抗鈣化處理指出了一條新的徑路。但去細胞處理后的瓣膜尚需進一步處理，以增強其力學強度和耐久性能。本研究擬選取經去細胞處理的豬主動脈瓣膜為基礎材料，應用一種新型的生物源性交

3、聯(lián)劑-----原青花素交聯(lián)處理，構建新型去細胞生物瓣，并通過體外、體內試驗，檢測原青花素處理去細胞瓣膜的生物學、理化、抗鈣化性能及組織、細胞相容性，為改進生物瓣交聯(lián)處理方法做新的探索。
　　第一部分：原花青素交聯(lián)處理去細胞豬主動脈瓣膜的構建及生物物理性能評價。取回新鮮豬主動脈瓣膜，按本實驗室建立方法經去細胞處理后，檢測其去細胞效果，進而經0.1％原花青素交聯(lián)處理后，檢測原花青素去細胞瓣膜的厚度、組織含水量、熱皺縮溫度、可溶性蛋白含

4、量、斷裂強度、耐久性、抗酶解性能、交聯(lián)度等生物生物物理性能，并與新鮮未去細胞瓣膜、去細胞瓣膜、戊二醛交聯(lián)去細胞瓣膜比較。結果顯示：去細胞效果滿意，細胞成分去除徹底，纖維支架保存完整；原花青素去細胞瓣膜組厚度（0.15±0.04）mm、含水量（89.1±3.4）％、熱皺縮溫度（71±4.1）℃，與未去細胞組（0.16±0.07）mm、（88.7±4.7）％、（74±2.9）℃，單純去細胞組（0.18±0.11）mm、（90.3±4.3）％

5、、（73.3±5.1）℃均無明顯差別（p>0.05），而與戊二醛處理組（0.27±0.08）mm、（75.1±3.9）％、（87.4±4.3）℃差別顯著（p<0.05）；而原花青素去細胞瓣膜組可溶性蛋白含量（0.71±0.22）％，與未去細胞組（2.16±0.32）％、單純去細胞組（1.47±0.27）％均差別顯著（p<0.05），而與戊二醛處理組（0.76±0.16）％無明顯差別（p>0.05）；原花青素去細胞瓣膜組斷裂強度（11.8

6、±0.91）mPa較其余各組（8.71±1.12）mPa、（8.25±1.07）mPa、（9.15±0.97）mPa均明顯增強；耐久性實驗發(fā)現(xiàn)原花青素處理組在PBS保存45天后斷裂強度無明顯變化；24h抗酶解實驗可見新鮮瓣膜組及去細胞瓣膜組至2h已幾乎全部降解，失重率接近100％，而降解24h后，原花青素去細胞瓣膜組和戊二醛處理組失重率分別為（10.21±1.8）％、（7.17±1.1）％，兩組間亦未見明顯差異。由上可知，原花青素處理去

7、細胞瓣膜，在去除細胞成分及鈣結晶核、降低免疫原性的同時，保持了完整的瓣膜構型和結構特點，具有較好的力學性能和生物學特性。
　　第二部分：原花青素交聯(lián)處理去細胞豬主動脈瓣膜生物相容性評價。進行原花青素去細胞瓣膜原花青素釋放試驗，并通過L929細胞直接、間接接觸細胞毒性實驗考察原花青素生物相容性。結果提示：處理后1d原花青素釋放到達高峰，濃度為798.32±52.31ug/ml，至4d后原花青素釋放濃度下降至7.31±1.12ug/m

8、l，爾后再無明顯釋放；間接接觸細胞毒性實驗提示不同時相的細胞毒性分級均為0－1級；直接接觸細胞毒性實驗中光鏡及掃描電鏡結果可見L929細胞貼壁生長，形態(tài)良好，隨時間延長，細胞數(shù)量增加，在各觀察點，實驗組和空白對照組細胞形態(tài)及數(shù)量均無明顯差別。由上可知，原花青素處理去細胞豬主動脈瓣細胞毒性低，生物相容性好，成纖維細胞能夠在其表面良好生長。
　　第三部分：原花青素交聯(lián)處理去細胞豬主動脈瓣膜抗鈣化性能評價。通過大鼠皮下包埋實驗，在1、2

9、、3、4、6、8、10、12周提取標本，進行大體觀察、組織切片HE染色、Masson染色觀察組織相容性，并行Von-Kossa染色、掃描電鏡-能譜分析檢測各組材料抗鈣化性能。結果提示包埋2w后組織炎癥反應輕微，材料保存完好；Von－Kossa染色提示包埋21d單純去細胞組可見輕度鈣化，戊二醛處理組出現(xiàn)明顯鈣化，原花青素處理組未見鈣鹽沉積；包埋63d，單純去細胞組鈣化程度明顯加重，戊二醛處理組鈣化明顯，原花青素處理組仍未見明顯鈣鹽沉積；掃

10、描電鏡-能譜分析結果顯示：包埋21d，單純去細胞組未見鈣峰出現(xiàn)，戊二醛處理組出現(xiàn)明顯鈣峰，原花青素處理組未見鈣峰出現(xiàn)；包埋63d，單純去細胞組出現(xiàn)少量鈣峰，戊二醛處理組鈣峰較前進一步增多、增高，原花青素處理組仍未見明顯鈣峰出現(xiàn)。由上提示，原花青素處理去細胞瓣具有良好的組織相容性和抗鈣化性能。
　　第四部分：原花青素交聯(lián)處理去細胞豬主動脈瓣膜人骨髓間充質干細胞種植實驗。經分離、純化、培養(yǎng)、鑒定人骨髓間充質干細胞，選取3-5代2×10

11、6cm-2種植于原花青素去細胞瓣膜，觀察人骨髓間充質干細胞在原花青素去細胞豬主動脈瓣的生長情況。結果提示：所獲得的細胞經流式細胞儀檢測，所培養(yǎng)的細胞不表達CD34，高表達CD44，CD44陽性率在(92.12±2.34)％，與平行對照組(3.57±1.16)％比較有顯著性差異(P<0.01)。免疫組化鑒定，MSCs具有特征性的表面標志，不表達CD34，而CD44表達強陽性。種植細胞后HE染色光鏡觀察，種植3天瓣膜表面單層細胞覆蓋，細胞具

12、有活性。種植7天，可見瓣膜表面覆蓋細胞層明顯增厚，多層細胞生長，具有活性，并有細胞分泌的細胞外基質。細胞未有向瓣膜深層生長趨勢，瓣膜基質完整。掃描電鏡觀察可見，種植7天，瓣膜表面細胞均勻覆蓋。種植14天后，瓣膜表面覆蓋細胞層明顯增厚，多層細胞生長。由上可知，原花青素瓣膜能夠提供細胞生長的微環(huán)境，而且細胞能夠發(fā)揮正常的生理功能。說明原花青素瓣膜具有良好的細胞相容性，且具有能夠在體外快速內皮化的特性。
　　通過以上實驗，初步揭示了原花