妊娠期子宮NK細胞的生物學特性研究.pdf

1、 目的: 胎兒是同種異基因產(chǎn)物，它攜帶被母體認為是外源的父系MHC分子，但卻能抵御母體免疫細胞的攻擊并在妊娠中存活，這其中的機制至今仍不十分清楚。八十年代末，Starkey和King發(fā)現(xiàn)妊娠子宮中有大量CD56brightNK細胞，其特殊的分布狀態(tài)和功能使人們認識到子宮NK細胞可能參與了胚胎的植入和母胎界面免疫平衡的維持。盡管目前對這個過程中的許多環(huán)節(jié)尚不清楚，但已初步證實，子宮NK細胞(uNK細胞)的數(shù)量或功能失調(diào)與病

2、理性妊娠(如流產(chǎn)和先兆子癇等)密切相關。研究uNK細胞在妊娠中的分布與機能，探討妊娠期外周血NK細胞(pNK細胞)和uNK細胞生物學特性的差異，揭示uNK細胞在子宮微環(huán)境中的生理功能及其對母胎界面免疫平衡網(wǎng)絡的影響，有利于人們進一步認識妊娠這一生理過程，并為臨床最終治療病理性妊娠提供了新的思路。 本實驗以妊娠早期pNK細胞、uNK細胞、蛻膜組織與滋養(yǎng)層組織作為主要的研究對象，達到以下研究目的： 1.研究妊娠子宮微環(huán)境中u

3、NK細胞表面NKG2A和NKG2D及其相應配體的表達，探討NKG2A與NKG2D的不平衡表達在母胎界面免疫耐受形成中的作用。 2.研究妊娠期子宮微環(huán)境中子宮NK細胞的生物學特性，探討uNK細胞與周圍的蛻膜組織及滋養(yǎng)層組織的生理功能及相互作用，比較妊娠子宮NK細胞與外周血NK細胞在生理學功能上的差異。 方法: 1.選擇30例孕6～9周的正常妊娠婦女，分離其新鮮蛻膜組織，除去絨毛，分離蛻膜和外周血淋巴細胞，采用流式細

4、胞儀測定NK細胞在蛻膜淋巴細胞和外周血淋巴細胞的分布及其表面NKG2A與NKG2D的表達，比較30例早孕婦女與30例未孕婦女外周血NK細胞表面NKG2A與NKG2D表達的差異；RT-PCR技術檢測早孕婦女滋養(yǎng)層組織中HLA-EmRNA和MICAmRNA的表達。 2.無菌取早孕婦女新鮮蛻膜組織及外周血標本，除去蛻膜組織中的絨毛，分離蛻膜淋巴細胞，同時分離外周血淋巴細胞，免疫磁珠技術純化uNK細胞與pNK細胞，流式細胞儀檢測其純度，

5、MTT法檢測uNK細胞與pNK細胞對K562的殺傷，效靶比分別為5：1，2.5：1，1.25：1，0.625：1。MTT法檢測uNK細胞與pNK細胞在4h，24h，48h，72h和96h的增殖情況。RT-PCR技術檢測uNK細胞與pNK細胞趨化、侵襲、促血管形成等生物學活性相關基因的轉(zhuǎn)錄水平，同時檢測其相應配體在蛻膜組織和滋養(yǎng)層組織的表達狀況。 結果: 1.妊娠子宮蛻膜淋巴細胞中NK細胞約占70％，流式細胞分析的結果顯示

6、，uNK細胞NKG2A的表達水平顯著高于pNK細胞，分別為97.86％±1.75％與33.35％±10.92％(x-±s)，二者差異有顯著性(P＜0.05)，在滋養(yǎng)層細胞中檢測到其配體HLA-E的表達；而與pNK細胞相比，uNK細胞表面NKG2D的表達與之較為相近，分別為93.21％±4.52％與97.80％±1.72％，但二者仍有顯著性差異(P＜0.05)，在滋養(yǎng)層組織未檢測到其相應配體MICAmRNA的表達。未孕婦女pNK細胞表面N

7、KG2A和NKG2D的表達分別為33.50％±8.45％與98.60％±1.18％，與早孕婦女相比無顯著性差異(P＜0.05)。 2. 經(jīng)CD56免疫磁珠處理后所獲得的uNK細胞(CD56brightCD3-)與pNK細胞(CD56dimCD3-)純度)95％。 2.1 MTT法檢測uNK細胞與pNK細胞對K562細胞的殺傷活性，發(fā)現(xiàn)在效靶比為5：1，2.5：1，1.25：1，0.625：1的條件下，uNK細胞的殺傷活性

8、遠低于pNK細胞。 2.2 MTT法檢測uNK細胞與pNK細胞在4h，24h，48h，72h和96h的增殖情況，發(fā)現(xiàn)uNK細胞的增殖活性略高于pNK細胞。 2.3 uNK細胞與pNK細胞均表達趨化因子受體CCR1，CCR5，CCR7，CXCR2，CXCR4和CX3CR1mRNA，且表達強度相近，其中CXCR4和CX3CR1mRNA的表達水平較高。 2.4 uNK細胞與pNK細胞均檢測到VEGF-A、VEGF-B、

9、VEGF-C和VEGF-EmRNA的表達，uNK細胞還表達PIGF和Ang2mRNA，同時蛻膜組織可表達VEGFR1，VEGFR2，VEGFR3，Tie-1和Tie-2mRNA，但在滋養(yǎng)層組織中僅檢測出VEGFR2和Tie-2mRNA的表達。 2.5 一些與血管形成相關的因子如homeoboxb3，COX-2，HIFα1，TGFβ1和TGFβ3mRNA也在uNK細胞與pNK細胞表達，iNOsmRNA僅在uNK細胞中檢出。2.6u

10、NK細胞還檢測到TIMP-1，TIMP-2和TIMP-3mRNA的表達。此外，發(fā)現(xiàn)uNK細胞中還表達OPN，perforin，granzyme，TNFα和FasLigandmRNA。 結論 1.蛻膜中的淋巴細胞主要為NK細胞，其免疫學表型與pNK細胞有較大的區(qū)別，妊娠期uNK細胞表面高表達抑制性受體NKG2A，同時滋養(yǎng)層組織表達相應的配體HLA-E，這可能是維持母胎界面免疫耐受的重要因素。早孕婦女pNK細胞NKG2A和N

11、KG2D的表達水平與未妊娠者相似，可見妊娠期pNK細胞NKG2A和NKG2D的表達較未妊娠時并無明顯變化。此外，uNK細胞NKG2A的表達水平較pNK細胞顯著升高，NKG2D的表達水平與之較為接近，提示uNK細胞與pNK細胞可能源于相同的前體細胞，由于二者的發(fā)育分化環(huán)境不同導致了表型和功能的差異。 2.妊娠期uNK細胞與pNK細胞的表型、增殖和殺傷活性有較大不同，其某些細胞因子及其受體的表達狀況與妊娠早期uNK細胞在蛻膜中的募集

12、和生理學功能有關。妊娠期外周血NK細胞在生理功能上與uNK細胞有較大相似性，它能產(chǎn)生多種生物活性因子，參予正常妊娠的維持，但與pNK細胞相比，uNK細胞有更強的促血管形成能力，因此被認為在母胎界面的血管重建中發(fā)揮重要功能。由此可見，uNK細胞是一群具有較強調(diào)節(jié)功能的NK細胞亞群，它通過表面受體(或配體)與蛻膜組織或滋養(yǎng)層組織表達的配體(或受體)相互作用，直接或通過分泌一系列細胞因子調(diào)控母胎界面的血管重建及胎盤與滋養(yǎng)層組織的生長和發(fā)育，并