人骨髓間充質干細胞與干骺端骨膜干細成骨化協(xié)同作用及構建組織工程化骨研究.pdf

1、目的：探討人骨髓間充質干細胞及干骺端骨膜干細胞成骨化協(xié)同作用，以及采用人骨髓間充質干細胞和干骺端骨膜干細胞共培養(yǎng)策略作為骨組織工程種子細胞的可行性。
　　 材料與方法：分離、培養(yǎng)人來源的骨髓間充質干細胞及干骺端骨膜干細胞，通過流式細胞儀及三向誘導進行間充質來源干細胞鑒定。以三種不同比例進行人來源骨髓間充質干細胞及干骺端骨膜干細胞的共培養(yǎng)和成骨誘導，并以同一個體來源的骨髓間充質干細胞和干骺端骨膜干細胞作為平行對照。在體外單層培養(yǎng)水

2、平，通過堿性磷酸酶染色，茜素紅染色，測定堿性磷酸酶活性、細胞鈣離子水平，應用Real-time PCR檢測成骨相關COL1αl、BMP-2、Osteopontin、Osteocalcin的基因表達，探討人來源骨髓間充質干細胞及干骺端骨膜干細胞的成骨化協(xié)同作用。將共培養(yǎng)的人骨髓間充質干細胞及干骺端骨膜干細胞接種β-TCP三維多孔支架，進一步探討在三維培養(yǎng)條件下，共培養(yǎng)人骨髓間充質干細胞及干骺端骨膜干細胞對成骨相關基因COL1α1、BMP-

3、2、Osteopontin和Osteocalcin mRNA轉錄的影響。建立裸鼠異位成骨及兔股骨髁松質骨極量骨缺損動物模型，將植入的組織工程骨于不同的時相點取出，通過H&E染色、van Oieson染色等形態(tài)學方法探討共培養(yǎng)人骨髓間充質干細胞及干骺端骨膜干細胞對在體新骨再生及成熟骨形成的影響，應用vWF免疫組織化學染色，觀察共培養(yǎng)人骨髓間充質干細胞及干骺端骨膜干細胞對組織工程化骨新生血管化的影響。
　　 結果：分離培養(yǎng)的人骨髓間

4、充質干細胞和干骺端骨膜干細胞均具有間充質干細胞的表型特征，具有向成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞等細胞系分化的潛能。在體外單層培養(yǎng)水平，與同一個體來源的骨髓間充質干細胞及干骺端骨膜干細胞相比，三組共培養(yǎng)人骨髓間充質干細胞及干骺端骨膜干細胞顯著增加細胞堿性磷酸酶活性，促進間充質干細胞的體外成骨礦化，提高細胞鈣離子水平。成骨相關基因COL1αl、Osteopontin的mRNA轉錄開始于成骨誘導早期，而BMP-2和Osteocalcin基因表達

5、峰值出現(xiàn)在成骨誘導后期。在單層培養(yǎng)水平及三維培養(yǎng)水平，共培養(yǎng)人骨髓間充質干細胞及干骺端骨膜干細胞均在不同時相點上調COL1α1、BMP-2、Osteopontin和Osteocalcin的基因表達。異位成骨的研究顯示，共培養(yǎng)人骨髓間充質干細胞及干骺端骨膜干細胞作為骨組織工程種子細胞，可明顯促進組織工程化骨的異位新骨形成及向成熟骨的轉化，并促進組織工程化骨的新生血管化。在兔股骨髁松質骨極量骨缺損修復過程中，共培養(yǎng)人骨髓間充質干細胞及干骺端

6、骨膜干細胞可顯著促進在體的新骨再生，提高成熟骨形成百分比。與同一個體來源的人骨髓間充質干細胞及干骺端骨膜干細胞相比，共培養(yǎng)人骨髓間充質干細胞及干骺端骨膜干細胞并不能提高組織工程化骨在骨缺損區(qū)的新生血管總數(shù)，但可明顯提高β-TCP孔徑中心區(qū)域的中心血管化程度。
　　 結論：人骨髓間充質干細胞和干骺端骨膜干細胞在體外、體內均顯示成骨化協(xié)同作用。將共培養(yǎng)的人骨髓間充質干細胞和干骺端骨膜干細胞作為骨組織工程種子細胞資源可提高組織工程化骨