USP18在干擾素-α治療慢性乙肝過程中的預(yù)測(cè)意義及作用機(jī)制.pdf

1、目的:乙型肝炎病毒（HBV）感染已經(jīng)成為全球公共健康問題，每年約有100萬人死于HBV感染相關(guān)的肝臟疾病。活動(dòng)性HBV復(fù)制是導(dǎo)致肝臟損傷和疾病進(jìn)展的關(guān)鍵因素，因此最大限度地長(zhǎng)期抑制或清除HBV成為慢性乙型肝炎治療的總體目標(biāo)。目前用于慢性乙型肝炎抗病毒治療的藥物主要有兩大類:1、核苷（酸）類似物;2、干擾素(interferon，IFN)。干擾素具有抗病毒和免疫調(diào)節(jié)雙重作用，治療療程短而確定、耐藥少見，故逐漸成為臨床治療慢性乙型肝炎的主要

2、選擇。然而，目前干擾素治療只能達(dá)到30％-40％的HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換，約有60％的患者盡管接受干擾素抗病毒治療，但仍然遭受乙肝病毒的侵害，因此短期內(nèi)預(yù)測(cè)干擾素治療療效顯得尤為重要，最新研究熱點(diǎn)是干擾素抗病毒作用信號(hào)通路中的干擾素刺激基因，泛素特異性蛋白酶18(Ubiquitin-specificprotease18，USP18)是其中重要的一個(gè)干擾素刺激基因。本研究旨在探討USP18在干擾素-α治療慢乙肝過程中的預(yù)測(cè)意義及作用機(jī)制。<

3、br>　　 方法:選取慢性HBV感染者70例，均為免疫清除期患者，所有患者均進(jìn)行肝組織活檢，無明顯干擾素抗病毒治療禁忌癥。留取受試者治療前新鮮外周血提取PBMCs進(jìn)行體外干擾素-α孵育刺激試驗(yàn)，并對(duì)受試者應(yīng)用干擾素-α抗病毒治療，進(jìn)行隨訪觀察24周，其中無病毒學(xué)應(yīng)答患者(nonvirologicalresponse，NVR)18例，完全病毒學(xué)應(yīng)答患者(completevirologicalresponse，CVR)32例，部分病毒學(xué)應(yīng)

4、答患者(partialvirologicalresponse，PVR)20例，健康對(duì)照10例。
　　 1、體外干擾素-α孵育PBMCs:留取70例受試者治療前新鮮外周靜脈血，密度梯度離心法分離PBMCs，無血清培養(yǎng)基懸浮沉淀細(xì)胞，分為兩組:第一組空白對(duì)照組（不加任何因子）;第二組加入干擾素-α因子刺激孵育PBMCs，4h后收集細(xì)胞。
　　 2、對(duì)所有受試者應(yīng)用干擾素-α抗病毒治療隨訪觀察，留取治療0周、1周、12周、24

5、周時(shí)新鮮外周血，密度梯度離心法分離收集PBMCs。
　　 3、Trizol法抽提外周血單個(gè)核細(xì)胞總RNA，應(yīng)用Real-timePCR法檢測(cè)USP18、STAT1mRNA的表達(dá)水平。
　　 4、RIPA法提取細(xì)胞總蛋白應(yīng)用westernblot法檢測(cè)USP18、STAT1、P-STAT1蛋白的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果:
　　 1、健康對(duì)照組外周血PBMCs中USP18的表達(dá)為陰性
　　 2、干擾素-

6、α治療過程外周血PBMCs中USP18mRNA水平變化
　　 70例CHB患者在干擾素-α治療過程中接受mRNA水平檢測(cè)，將PBMCs中內(nèi)參GAPDH相對(duì)表達(dá)量設(shè)定為1.00，與GAPDH表達(dá)量相比較，干擾素-α治療前NVR組PBMCs中USP18的表達(dá)水平(0.073±0.026)較CVR組(0.043±0.023)及PVR組(0.044±0.022)高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=10.665，P＜0.01）;治療1周時(shí)，各組PB

7、MCs中USP18的表達(dá)水平明顯升高，NVR組(0.098±0.023)、CVR組(0.071±0.027)、PVR組(0.074±0.027)，NVR組表達(dá)水平最高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=6.781，P=0.002）;治療12周及24周時(shí)，各組表達(dá)水平為NVR組(0.097±0.024)(0.096±0.023)、CVR組(0.069±0.025)(0.066±0.025)、PVR組(0.075±0.026)(0.074±0.025)

8、，NVR組表達(dá)水平仍最高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F1=7.140，p=0.002;F2=8.654,P＜0.01)。
　　 3、干擾素-α治療過程外周血PBMCs中USP18蛋白水平變化
　　 將PBMCs中內(nèi)參β-actin相對(duì)表達(dá)量設(shè)定為1.00，與β-actin表達(dá)量相比較，干擾素-僅治療前NVR組外周血PBMCs中USP18的表達(dá)水平(0.308±0.046)較CVR組(0.250±0.044)及PVR組(0.248

9、±0.048)高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=11.151，P＜0.01);治療1周后，各組USP18的表達(dá)水平明顯升高，NVR組(0.563±0.050)、CVR組(0.431±0.047)、PVR組(0.428±0.047)，NVR組表達(dá)水平最高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=51.722，P＜0.01);治療12周及24周時(shí)，各組表達(dá)水平為NVR組(0.568±0.051)(0.566±0.049)、CVR組(0.430±0.047)(0.42

10、9±0.045)、PVR組(0.426±0.047)(0.430±0.049)，NVR組表達(dá)水平仍最高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F1=55.958，P＜0.01;F2=55.841,P＜0.01)。
　　 4、體外干擾素-α孵育刺激PBMCs后形態(tài)學(xué)觀察
　　 PBMCs經(jīng)2h貼壁后，可見部分細(xì)胞懸浮，多數(shù)細(xì)胞為B細(xì)胞和外周血DC，干擾素-α孵育刺激4h后未見形態(tài)學(xué)變化，細(xì)胞數(shù)目無明顯變化。
　　 5、體外干擾素-α刺

11、激PBMCs后USP18、STAT-1Mrna/蛋白水平變化
　　 體外干擾素-α刺激治療前外周血PBMCs后，干擾素-α組PBMCs中USP18在mRNA/蛋白上的表達(dá)水平高于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，而NVR組、CVR組及PVR組外周血PBMCs中STAT-1mRNA及其蛋白水平無顯著性差異。
　　 6、體外干擾素-僅刺激PBMCs后USP18表達(dá)水平與P-STAT-1表達(dá)水平的相關(guān)性
　　

12、 空白對(duì)照組及干擾素-α組PBMCs中P-STAT-1表達(dá)水平分別為:NVR組（0.25±0.02）、（0.58±0.05），CVR組（0.26±0.02）、（0.66±0.05），PVR組（0.26±0.01）、（0.65±0.05），干擾素-α組PBMCs中P-STAT-1表達(dá)水平高于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，回歸分析結(jié)果顯示:干擾素-α刺激后PBMCs中USP18的表達(dá)水平與P-STAT-1的表達(dá)水平成負(fù)相關(guān)

13、性，相關(guān)系數(shù)為:-0.753(P＜0.01)。
　　 7、多種影響因素與干擾素-α治療療效的回歸分析
　　 將受試者的年齡、治療前HBV-DNA基線水平、肝組織炎癥分級(jí)、治療前ALT水平、及治療前PBMCs中USP18的表達(dá)水平多種因素與干擾素-α治療療效進(jìn)行l(wèi)ogisitic回歸分析，通過逐步排除法，病毒載量、肝組織炎癥分級(jí)及治療前PBMCs中USP18的表達(dá)水平進(jìn)入回歸方程，y=0.588+20.552x1-39.2

14、99x2+19.641x3，回歸方程有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=35.682，P＜0.01)。
　　 結(jié)論:
　　 1、USP18的表達(dá)受干擾素刺激機(jī)體強(qiáng)烈誘導(dǎo)。
　　 2、USP18通過干擾STAT1的磷酸化作用，抑制干擾素-α抗病毒信號(hào)通路。
　　 3、HBV-DNA基線水平、肝臟炎癥分級(jí)及治療前PBMCs中USP18表達(dá)水平與干擾素-α治療療效均存在相關(guān)性，受試者治療前PBMCs中高水平表達(dá)USP18影響干