ISG15-USP18信號(hào)通路在乙肝病毒耐受干擾素中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　由乙肝病毒(hepatitis B virus，HBV)感染引起的乙型肝炎是嚴(yán)重的世界性公共衛(wèi)生問題之一。目前全球范圍內(nèi)約有2.4億慢性HBV感染者，每年有近70萬(wàn)人死于HBV感染相關(guān)的疾病。在抗乙肝病毒治療中，Ⅰ型干擾素是各肝病研究學(xué)會(huì)推薦的一線藥物之一，但仍然存在著病毒耐藥等亟待解決的問題，而其具體耐藥機(jī)制尚不完全明確。
　　Ⅰ型干擾素作為固有免疫系統(tǒng)的重要成員，具有廣譜抗病毒作用和重要的免疫調(diào)節(jié)功能，干擾素

2、刺激基因是其發(fā)揮作用的最終效應(yīng)分子。本團(tuán)隊(duì)前期研究表明，干擾素治療前慢性乙肝患者肝組織內(nèi)位于同一信號(hào)路上的兩個(gè)干擾素刺激基因ISG15(Interferon stimulated gene15)和USP18(Ubiquitin specific peptidase18)的細(xì)胞表達(dá)特異性與療效有關(guān):治療有效者中，ISG15/USP18主要在肝臟巨噬細(xì)胞（Kupffer細(xì)胞）中高表達(dá)，而治療無(wú)效者中則主要在肝細(xì)胞中表達(dá)。在慢性丙肝患者中也有

3、類似現(xiàn)象。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，USP18敲除小鼠巨噬細(xì)胞主要為M2型，與野生型小鼠體內(nèi)巨噬細(xì)胞主要為M1型截然不同。ISG15敲除小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能受到抑制，提示ISG15/USP18信號(hào)通路與巨噬細(xì)胞表型和功能密切相關(guān)。這些研究結(jié)果表明該信號(hào)通路在調(diào)節(jié)宿主固有免疫（影響干擾素抗病毒活性及巨噬細(xì)胞極化和功能）及肝炎病毒耐受干擾素導(dǎo)致持續(xù)感染中發(fā)揮著重要作用。
　　本課題旨在從如下幾個(gè)方面明確ISG15/USP18信號(hào)通路在乙肝病毒感染

4、中的作用:1）ISG15/USP18信號(hào)通路對(duì)乙肝病毒復(fù)制的影響;2)ISG15/USP18對(duì)巨噬細(xì)胞極化和功能的影響;3）不同表型巨噬細(xì)胞(M1/M2)對(duì)肝細(xì)胞中干擾素信號(hào)通路的影響。為進(jìn)一步闡明乙肝病毒慢性化過程及其耐受干擾素的機(jī)制尋找證據(jù)，并為篩選潛在的新型乙型肝炎治療藥物靶點(diǎn)提供理論支持。
　　方法:
　　1.通過轉(zhuǎn)染高表達(dá)質(zhì)粒，在能夠產(chǎn)生感染性乙肝病毒顆粒的HepG2.2.15細(xì)胞中高表達(dá)ISG15、USP18或無(wú)

5、酶活性的USP18-C64S，通過real-time PCR，western blot及ELISA等方法檢測(cè)HBV復(fù)制情況;
　　2.通過轉(zhuǎn)染高表達(dá)質(zhì)粒，在THP-1來(lái)源的M0巨噬細(xì)胞中高表達(dá)ISG15或USP18，然后誘導(dǎo)細(xì)胞極化。通過real-time PCR，流式細(xì)胞術(shù)，乳膠微粒吞噬實(shí)驗(yàn)，中性紅攝取實(shí)驗(yàn)等，檢測(cè)ISG15/USP18對(duì)巨噬細(xì)胞標(biāo)志物（細(xì)胞因子、酶及表面分子等）表達(dá)、活性氧化物產(chǎn)生、吞噬功能以及胞飲功能的影響。

6、
　　3.(1)將從USP18基因敲除小鼠及野生型小鼠分離到的腹腔滲出巨噬細(xì)胞（M1型和M2型）分別與野生型小鼠的原代肝細(xì)胞通過transwell系統(tǒng)進(jìn)行共培養(yǎng)，在共培養(yǎng)后不同的時(shí)間點(diǎn)收集培養(yǎng)基上清，ELISA檢測(cè)上清液中代表性M1/M2型細(xì)胞因子的表達(dá)情況。同時(shí)使用干擾素刺激肝細(xì)胞，real-time PCR檢測(cè)肝細(xì)胞中干擾素刺激基因的表達(dá)情況，評(píng)價(jià)肝細(xì)胞對(duì)干擾素刺激的反應(yīng)（敏感性）。
　　(2)使用氯膦酸二鈉脂質(zhì)體特異性

7、地清除野生型小鼠體內(nèi)的巨噬細(xì)胞(M1型)，然后通過尾靜脈注射的方式用從USP18基因敲除小鼠分離到的腹腔滲出巨噬細(xì)胞(M2型)對(duì)其進(jìn)行外源性巨噬細(xì)胞置換。通過LPS制造炎性微環(huán)境激活置換的巨噬細(xì)胞，然后經(jīng)由腹腔注射干擾素，評(píng)價(jià)小鼠肝組織對(duì)干擾素刺激的反應(yīng):ELISA檢測(cè)小鼠血清中代表性M1/M2型細(xì)胞因子的表達(dá);real-time PCR檢測(cè)肝細(xì)胞中干擾素刺激基因的表達(dá);HE染色及血清酶學(xué)檢測(cè)評(píng)價(jià)小鼠肝臟炎癥水平。
　　結(jié)果:

8、r>　　1.高表達(dá)ISG15或USP18以劑量依賴的方式促進(jìn)HepG2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)基中HBV DNA的表達(dá)，但對(duì)細(xì)胞內(nèi)總HBV DNA、cccDNA、pgRNA、HBcAg及培養(yǎng)基中的HBeAg和HBsAg沒有明顯影響。siRNA抑制ISGylation所必需的E1激活酶UBE1L的表達(dá)之后，ISGylation水平明顯下降，ISG15對(duì)HBV的這種促進(jìn)作用也隨著消失;而與野生型USP18相比，無(wú)酶活性的USP18C64S對(duì)HBV

9、有著類似的作用。高表達(dá)ISG15或USP18能夠促進(jìn)部分干擾素刺激基因的表達(dá)，但是對(duì)內(nèi)源性Ⅰ型干擾素的表達(dá)沒有明顯影響。
　　2.在PMA誘導(dǎo)分化的M0THP-1巨噬細(xì)胞中高表達(dá)ISG15或USP18都能夠促進(jìn)M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)、抑制M2型標(biāo)志物的表達(dá)，降低巨噬細(xì)胞對(duì)中性紅溶液的攝取、降低ROS的表達(dá)，并抑制巨噬細(xì)胞對(duì)熒光標(biāo)記乳膠微粒的吞噬。
　　3.(1)USP18基因敲除小鼠腹腔滲出巨噬細(xì)胞主要表達(dá)M2型細(xì)胞因子

10、（GM-CSF以及IL-10），而野生型小鼠腹腔滲出巨噬細(xì)胞主要表達(dá)M1型細(xì)胞因子（TNF-α及IL-12）。Ⅰ型干擾素刺激后，與USP18基因敲除小鼠腹巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)的肝細(xì)胞中干擾素刺激基因Mx1、ISG15及USP18表達(dá)明顯高于對(duì)照組。
　　(2)與對(duì)照組相比，進(jìn)行了USP18基因敲除小鼠巨噬細(xì)胞置換的野生型小鼠血清中M2型細(xì)胞因子表達(dá)水平更高;在Ⅰ型干擾素刺激下，實(shí)驗(yàn)組小鼠肝組織中干擾素刺激基因Mx1、ISG15及USP1

11、8表達(dá)明顯更高;HE染色顯示，LPS處理并不導(dǎo)致嚴(yán)重炎癥反應(yīng)，但血清酶學(xué)顯示，LPS處理會(huì)對(duì)肝臟功能造成一定損傷，而巨噬細(xì)胞置換能夠逆轉(zhuǎn)LPS引起的小鼠ALT和AST的升高。
　　結(jié)論:
　　1.ISG15/USP18的高表達(dá)對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞中HBV的產(chǎn)生有促進(jìn)作用，這種作用與ISGylation有關(guān)，而不依賴于USP18的酶活性及內(nèi)源性干擾素信號(hào)通路。
　　2.高表達(dá)ISG15或USP18能夠促進(jìn)PMA誘導(dǎo)

12、分化的M0THP-1巨噬細(xì)胞向M1型極化，抑制巨噬細(xì)胞吞噬、胞飲及ROS產(chǎn)生等功能。
　　3.M2型巨噬細(xì)胞很可能通過釋放細(xì)胞因子、調(diào)節(jié)炎癥微環(huán)境的方式提高肝細(xì)胞對(duì)Ⅰ型干擾素的敏感性。
　　綜上所述，ISG15/USP18信號(hào)通路至少可能通過兩種不同的機(jī)制造成HBV耐受干擾素，并有利于HBV持續(xù)感染:1）ISG15/USP18在肝細(xì)胞中高表達(dá)時(shí)，以不依賴于內(nèi)源性干擾素信號(hào)通路的方式促進(jìn)肝細(xì)胞中HBV的產(chǎn)生（釋放）;2）ISG