肥大細(xì)胞羧肽酶對類糜蛋白酶促血管生成作用影響的初步研究.pdf

1、[目的]
　　 建立動物海綿移植血管生成模型,利用該模型研究肥大細(xì)胞羧肽酶(MC-CP)對類糜蛋白酶(MC-Chy)促血管生成作用的影響。
　　 [方法]
　　 (1)設(shè)計特異引物,擴(kuò)增人MC-Chy的編碼基因,通過酶切、連接,將目的片段插入真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1,構(gòu)建MC-Chy的分泌性真核表達(dá)載體pcDNA3.1/Chy。
　　 (2)分別大量提取人MC-Chy和MC-CP真核表達(dá)質(zhì)粒。

2、　　 (3)將經(jīng)過麻醉后的倉鼠的背部皮膚正中行縱行切口,通過該切口做成頭側(cè)與尾側(cè)2個皮下囊袋,把聚乙烯醇海綿分別植入每個囊袋內(nèi),縫合切口,構(gòu)建成動物海綿移植血管生成模型。
　　 (4)在建立海綿移植模型的基礎(chǔ)上,在倉鼠皮下移植的海綿塊的周圍部位注射pcDNA3.1/Clay表達(dá)質(zhì)粒。第7天處死倉鼠,取下移植的海綿塊,用剪刀剪殲兩半,一半測定血紅蛋白,另一半進(jìn)行HE染色和血管內(nèi)皮細(xì)胞的免疫組織化學(xué)染色。
　　 (5)用類

3、似的辦法來觀察共轉(zhuǎn)染MC-CP和MC-Chy質(zhì)粒對血管形成的影響。術(shù)后第1天和第5天,在倉鼠皮下移植的海綿塊的周圍部位同時注射pcDNA3.1/CP和pcDNA3.1/Chy表達(dá)質(zhì)粒,取下海綿塊后分別測定血紅蛋白和血管內(nèi)皮細(xì)胞的免疫組織化學(xué)染色。
　　 [結(jié)果]
　　 (1)成功構(gòu)建了pcDNA3.1/Chy表達(dá)載體,并大量制備了高純度、無內(nèi)毒素的人MC-Chy和MC-CP分泌性真核表達(dá)質(zhì)粒。
　　 (2)建立倉

4、鼠海綿移植血管生成模型,用于分析MC-Chy在血管生成中的作用,移植的海綿內(nèi)的血紅蛋白含量分析顯示,pcDNA3.1/Chy表達(dá)質(zhì)粒處理組的血紅蛋白含量明顯比對照組高;免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)pcDNA3.1/Chy質(zhì)粒處理組的移植海綿血管密度高于對照組,表明MC-Chy具有促血管生成作用。
　　 (3)在用倉鼠海綿移植模型分析MC-CP對MC-Chy具有促血管生成的影響,移植的海綿內(nèi)的血紅蛋白含量分析顯示,高濃度pcDNA3.1/

5、CP與pcDNA3.1/Clay表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組的血紅蛋白含量明顯比只轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/Chy表達(dá)質(zhì)粒組低,而低濃度pcDNA3.1/CP與pcDNA3.1/Chy表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組和只轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/Chy質(zhì)粒組相比則沒有顯著差別;免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)高濃度pcDNA3.1/CP與pcDNA3.1/Chy質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組的血管密度值比只轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/Chy組低,而低濃度pcDNA3.1/CP與pcDNA3.1/Chy表達(dá)共