抑制肥大細(xì)胞類胰蛋白酶表達(dá)對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞合成、分泌炎癥介質(zhì)的影響.pdf

1、動(dòng)脈粥樣硬化是一種慢性炎癥性疾病。在動(dòng)脈粥樣硬化病變過(guò)程中,單核細(xì)胞進(jìn)入血管內(nèi)膜分化為巨噬細(xì)胞并釋放多種細(xì)胞因子,進(jìn)一步趨化、聚集白細(xì)胞,并使白細(xì)胞遷移進(jìn)入血管內(nèi)膜,合成、釋放大量細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì),損害血管.內(nèi)皮細(xì)胞功能。在血管炎癥發(fā)展過(guò)程中,肥大細(xì)胞從血管周圍遷移進(jìn)入內(nèi)膜并被激活?；罨姆蚀蠹?xì)胞通過(guò)脫顆粒的方式釋放多種分泌型介質(zhì),包括類胰蛋白酶、糜蛋白酶、組胺和肝素。類胰蛋白酶是一種具有多種生物學(xué)活性的天然蛋白酶。在心血管系統(tǒng)中,類

2、胰蛋白酶激活平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和心肌細(xì)胞上的PAR-2,引起血管舒張和收縮,細(xì)胞有絲分裂,細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高,von Willebrand因子釋放以及一氧化氮釋放等生物學(xué)效應(yīng)。類胰蛋白酶與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。類胰蛋白酶能夠招募中性粒細(xì)胞,啟動(dòng)炎癥反應(yīng)；能夠刺激內(nèi)皮細(xì)胞合成IL-1β和IL-8,并促進(jìn)IL-8的釋放,通過(guò)IL-8的作用進(jìn)一步促使白細(xì)胞聚集、浸潤(rùn),參與血管炎癥反應(yīng)。
　　 血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的紊亂和失調(diào)

3、是動(dòng)脈粥樣硬化血管炎性病變的早期病理改變。在這一過(guò)程中,單核.巨噬細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞合成并分泌多種炎癥介質(zhì),破壞內(nèi)皮細(xì)胞功能,增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞層通透性,促進(jìn)血管炎癥發(fā)展。在這些炎癥介質(zhì)中,IL-6和TNF-α對(duì)促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化血管炎性病變的形成和發(fā)展起了非常重要的介導(dǎo)作用。IL-6通過(guò)刺激肝臟,誘導(dǎo)C反應(yīng)蛋白大量生成,參與動(dòng)脈粥樣硬化的早期炎癥反應(yīng)。TNF-α是炎癥反應(yīng)中最重要的啟動(dòng)因子之一,通過(guò)激活NF-κB,促進(jìn)多種炎癥介質(zhì)釋放

4、,使炎癥反應(yīng)產(chǎn)生級(jí)聯(lián)效應(yīng),介導(dǎo)血管炎癥的發(fā)展。研究證實(shí),類胰蛋白酶通過(guò)激活細(xì)胞膜上的PAR-2促進(jìn)單核細(xì)胞合成并分泌IL-6、TNF-α和IL-1β,從而影響動(dòng)脈粥樣硬化的血管炎性病變過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)室證實(shí),類胰蛋白酶通過(guò)激活PAR-2上調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞IL-6和TNF-α的mRNA表達(dá)及蛋白分泌,并呈時(shí)間依賴性和濃度依賴性。
　　 本實(shí)驗(yàn)中,運(yùn)用RNA干擾的方法,根據(jù)類胰蛋白酶序列設(shè)計(jì)siRNA片段,將siRNA-載體轉(zhuǎn)染肥大細(xì)胞P

5、815,通過(guò)RT-PCR檢測(cè)P815細(xì)胞中類胰蛋白酶的mRNA表達(dá)。結(jié)果顯示,RNA干擾能夠明顯抑制P815細(xì)胞表達(dá)類胰蛋白酶。在建立P815細(xì)胞類胰蛋白酶表達(dá)抑制模型的基礎(chǔ)上,制作、收集類胰蛋白酶正常表達(dá)(P815條件培養(yǎng)液)和類胰蛋白酶表達(dá)抑制(siRNA-P815條件培養(yǎng)液)兩種不同的條件培養(yǎng)液,并通過(guò)ELISA檢測(cè)不同條件培養(yǎng)液中類胰蛋白酶的含量。結(jié)果顯示,siRNA-P815條件培養(yǎng)液中類胰蛋白酶含量明顯低于P815條件培養(yǎng)液

6、。用不同條件培養(yǎng)液培養(yǎng)bEnd.3細(xì)胞后,分別通過(guò)RT-PCR和ELISA檢測(cè)bEnd.3細(xì)胞IL-6和TNF-α的mRNA表達(dá)及蛋白分泌。結(jié)果顯示,用siRNA-P815條件培養(yǎng)液培養(yǎng)的bEnd.3細(xì)胞,其IL-6和TNF-α的mRNA表達(dá)水平及蛋白分泌水平明顯低于用P815條件培養(yǎng)液培養(yǎng)的細(xì)胞,而略高于用DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)的細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)證明,肥大細(xì)胞類胰蛋白酶能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞合成并分泌IL-6和TNF-α;抑制類肥大細(xì)胞胰蛋白酶表