抑制肥大細胞類胰蛋白酶表達對血管內(nèi)皮細胞合成、分泌炎癥介質(zhì)的影響.pdf

1、動脈粥樣硬化是一種慢性炎癥性疾病。在動脈粥樣硬化病變過程中,單核細胞進入血管內(nèi)膜分化為巨噬細胞并釋放多種細胞因子,進一步趨化、聚集白細胞,并使白細胞遷移進入血管內(nèi)膜,合成、釋放大量細胞因子和炎癥介質(zhì),損害血管.內(nèi)皮細胞功能。在血管炎癥發(fā)展過程中,肥大細胞從血管周圍遷移進入內(nèi)膜并被激活?；罨姆蚀蠹毎ㄟ^脫顆粒的方式釋放多種分泌型介質(zhì),包括類胰蛋白酶、糜蛋白酶、組胺和肝素。類胰蛋白酶是一種具有多種生物學(xué)活性的天然蛋白酶。在心血管系統(tǒng)中,類

2、胰蛋白酶激活平滑肌細胞、內(nèi)皮細胞和心肌細胞上的PAR-2,引起血管舒張和收縮,細胞有絲分裂,細胞內(nèi)鈣離子濃度升高,von Willebrand因子釋放以及一氧化氮釋放等生物學(xué)效應(yīng)。類胰蛋白酶與動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。類胰蛋白酶能夠招募中性粒細胞,啟動炎癥反應(yīng)；能夠刺激內(nèi)皮細胞合成IL-1β和IL-8,并促進IL-8的釋放,通過IL-8的作用進一步促使白細胞聚集、浸潤,參與血管炎癥反應(yīng)。
　　 血管內(nèi)皮細胞功能的紊亂和失調(diào)

3、是動脈粥樣硬化血管炎性病變的早期病理改變。在這一過程中,單核.巨噬細胞、平滑肌細胞和內(nèi)皮細胞合成并分泌多種炎癥介質(zhì),破壞內(nèi)皮細胞功能,增強內(nèi)皮細胞層通透性,促進血管炎癥發(fā)展。在這些炎癥介質(zhì)中,IL-6和TNF-α對促進動脈粥樣硬化血管炎性病變的形成和發(fā)展起了非常重要的介導(dǎo)作用。IL-6通過刺激肝臟,誘導(dǎo)C反應(yīng)蛋白大量生成,參與動脈粥樣硬化的早期炎癥反應(yīng)。TNF-α是炎癥反應(yīng)中最重要的啟動因子之一,通過激活NF-κB,促進多種炎癥介質(zhì)釋放

4、,使炎癥反應(yīng)產(chǎn)生級聯(lián)效應(yīng),介導(dǎo)血管炎癥的發(fā)展。研究證實,類胰蛋白酶通過激活細胞膜上的PAR-2促進單核細胞合成并分泌IL-6、TNF-α和IL-1β,從而影響動脈粥樣硬化的血管炎性病變過程。本實驗室證實,類胰蛋白酶通過激活PAR-2上調(diào)血管內(nèi)皮細胞IL-6和TNF-α的mRNA表達及蛋白分泌,并呈時間依賴性和濃度依賴性。
　　 本實驗中,運用RNA干擾的方法,根據(jù)類胰蛋白酶序列設(shè)計siRNA片段,將siRNA-載體轉(zhuǎn)染肥大細胞P

5、815,通過RT-PCR檢測P815細胞中類胰蛋白酶的mRNA表達。結(jié)果顯示,RNA干擾能夠明顯抑制P815細胞表達類胰蛋白酶。在建立P815細胞類胰蛋白酶表達抑制模型的基礎(chǔ)上,制作、收集類胰蛋白酶正常表達(P815條件培養(yǎng)液)和類胰蛋白酶表達抑制(siRNA-P815條件培養(yǎng)液)兩種不同的條件培養(yǎng)液,并通過ELISA檢測不同條件培養(yǎng)液中類胰蛋白酶的含量。結(jié)果顯示,siRNA-P815條件培養(yǎng)液中類胰蛋白酶含量明顯低于P815條件培養(yǎng)液

6、。用不同條件培養(yǎng)液培養(yǎng)bEnd.3細胞后,分別通過RT-PCR和ELISA檢測bEnd.3細胞IL-6和TNF-α的mRNA表達及蛋白分泌。結(jié)果顯示,用siRNA-P815條件培養(yǎng)液培養(yǎng)的bEnd.3細胞,其IL-6和TNF-α的mRNA表達水平及蛋白分泌水平明顯低于用P815條件培養(yǎng)液培養(yǎng)的細胞,而略高于用DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)的細胞。實驗證明,肥大細胞類胰蛋白酶能夠促進血管內(nèi)皮細胞合成并分泌IL-6和TNF-α;抑制類肥大細胞胰蛋白酶表