肥大細(xì)胞類(lèi)胰蛋白酶對(duì)人腎成纖維細(xì)胞影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:肥大細(xì)胞類(lèi)胰蛋白酶已被證明在皮膚、肺成纖維細(xì)胞和肝星型細(xì)胞增生和膠原合成中具有重要作用.該實(shí)驗(yàn)研究肥大細(xì)胞類(lèi)胰蛋白酶(tryptase)及蛋白水解酶抑制劑苯甲脒(benzamidine hydrochloride hydrate,BZ)對(duì)人腎成纖維細(xì)胞的影響,以探討肥大細(xì)胞類(lèi)胰蛋白酶在腎纖維化過(guò)程中的作用.方法:收集因腎腫瘤作腎切除術(shù)的人腎標(biāo)本,取遠(yuǎn)離腫瘤部位的腎組織(經(jīng)光鏡檢查,無(wú)腫瘤細(xì)胞),分離、培養(yǎng)人腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞.應(yīng)用細(xì)

2、胞形態(tài)學(xué)、免疫細(xì)胞化學(xué)和電鏡鑒定培養(yǎng)的細(xì)胞為人腎成纖維細(xì)胞后,分為以下各實(shí)驗(yàn)組:1. 各濃度類(lèi)胰蛋白酶加等量肝素(wt/wt):(1)0ng/ml類(lèi)胰蛋白酶+0ng/ml肝素;(2)10ng/ml類(lèi)胰蛋白酶+10ng/ml肝素;(3)100ng/ml類(lèi)胰蛋白酶+100ng/ml肝素;(4)500ng/ml類(lèi)胰蛋白酶+500ng/ml肝素.2. 不加肝素的各濃度類(lèi)胰蛋白酶:(1)0ng/ml類(lèi)胰蛋白酶;(2)10ng/ml類(lèi)胰蛋白酶;(3

3、)100ng/ml類(lèi)胰蛋白酶;(4)500ng/ml類(lèi)胰蛋白酶.3.各濃度肝素單獨(dú)作用:(1)0ng/ml肝素;(2)10ng/ml肝素;(3)100ng/ml肝素;(4)500ng/ml肝素.4.200umol/L蛋白水解酶抑制劑苯甲脒(benzamidine hydrochloride hydrate,BZ)處理組:(1)10ng/ml類(lèi)胰蛋白酶+10ng/ml肝素+200umol/L BZ;(2)100ng/ml類(lèi)胰蛋白酶+100

4、ng/ml肝素+200umol/L BZ;(3)500ng/ml類(lèi)胰蛋白酶+500ng/ml肝素+200umol/L BZ.5.10ug/ml TGF-β抗體處理組:(1)10ng/ml類(lèi)胰蛋白酶+10ng/ml肝素+10ug/ml TGF-β抗體;(2)100ng/ml類(lèi)胰蛋白酶+100ng/ml肝素+10ug/mlTGF-β抗體;(3)500ng/ml類(lèi)胰蛋白酶+500ng/ml肝素+10ug/mlTGF-β抗體.各組細(xì)胞培養(yǎng)48h

5、后,檢測(cè)人腎成纖維細(xì)胞的增生狀態(tài),I型膠原、蛋白水解酶激活受體2(protease activated receptor-2, PAR2)、單核細(xì)胞趨化蛋白1(monocyte chemoattractant protein-1, MCP1)以及α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(Alpha-smooth muscle actin,α-SMA)的表達(dá).成纖維細(xì)胞的增生狀態(tài)采用四甲基偶氮唑鹽(Methylthio tetrazole, MTT)比色法檢測(cè)

6、.I型膠原、PAR2、MCP1mRNA的表達(dá)采用半定量反轉(zhuǎn)錄-多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)方法檢測(cè).Α-SMA蛋白表達(dá)采用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè). 結(jié)果:1. 原代培養(yǎng)的人腎組織細(xì)胞,在倒置顯微鏡下呈梭型生長(zhǎng);免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示所培養(yǎng)細(xì)胞波形蛋白(vimentin)和α-SMA陽(yáng)性,角蛋白(keratin)和CD34陰性;電鏡下可見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)有

7、大量微絲、高爾基復(fù)合體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng),證明我們所培養(yǎng)的細(xì)胞是人腎成纖維細(xì)胞;2. 類(lèi)胰蛋白酶在10~500ng/ml范圍內(nèi),以劑量依賴(lài)方式促進(jìn)人腎成纖維細(xì)胞增生,最高達(dá)對(duì)照組的3.07倍.在200umol/L苯甲脒作用下,類(lèi)胰蛋白酶的促培養(yǎng)細(xì)胞增生效應(yīng)被抑制,最高可抑制81﹪;3. 半定量RT-PCR法擴(kuò)增PAR2、I型膠原和MCP1mRNA(324bp、332bp、257bp)結(jié)果表明:在等量肝素存在條件下,類(lèi)胰蛋白酶在10~500ng

8、/ml范圍內(nèi),以劑量依賴(lài)方式促進(jìn)培養(yǎng)的人腎成纖維細(xì)胞表達(dá)I型膠原、PAR2和MCP1,最高分別達(dá)對(duì)照組的3.14、3.71、4.98倍.200umol/L苯甲脒能抑制類(lèi)胰蛋白酶對(duì)培養(yǎng)的人成纖維細(xì)胞表達(dá)I型膠原、PAR2和MCP1的促進(jìn)作用,抑制率為53﹪~84﹪.結(jié)論:1.該實(shí)驗(yàn)成功培養(yǎng)了人腎成纖維細(xì)胞.2. 在肝素的協(xié)同作用下,類(lèi)胰蛋白酶能刺激體外培養(yǎng)的人腎成纖維細(xì)胞增生、活化,表達(dá)PAR2和MCP1等致炎致纖維化因子,表達(dá)腎間質(zhì)EC