人肥大細胞類糜蛋白酶的原核表達及其多克隆抗體的制備.pdf

1、【目的】 克隆人肥大細胞類糜蛋白酶(chymase)編碼區(qū)基因(CMA)，并在大腸桿菌中進行原核表達，制備重組類糜蛋白酶，以之為免疫原免疫家兔制備其多克隆抗體，為進一步研究類糜蛋白酶的生物學功能及建立類糜蛋白酶免疫學檢測方法奠定基礎。 【方法】 (1)通過RT-PCR克隆人肥大細胞類糜蛋白酶cDNA； (2)采用Gateway技術(shù)構(gòu)建表達載體pDEST17/CMA； (3)將表達載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌B

2、L21-AI，以L-阿拉伯糖為誘導劑誘導重組蛋白表達； (4)利用Ni-NTA 層析柱，采用親和層析法純化重組蛋白； (5)利用純化的重組類糜蛋白酶為免疫原免疫家兔制備多克隆抗體，并以間接ELISA測定抗體效價，Western blot鑒定抗體的特異性。 【結(jié)果】 (1)通過RT-PCR成功克隆了人肥大細胞類糜蛋白酶cDNA； (2)利用Gateway 技術(shù)成功地構(gòu)建了類糜蛋白酶表達載體pDEST

3、17/CMA； (3)在大腸桿菌 BL21-AI中，以 L-阿拉伯糖為誘導劑成功誘導了重組人肥大細胞類糜蛋白酶的表達，并采用了親和層析將其純化； (4)利用純化的重組類糜蛋白酶為免疫原免疫家兔，成功制備了兔抗人類糜蛋白酶多克隆抗體，ELISA 結(jié)果顯示效價大于1:12800，Western blot 分析表明該抗體能特異結(jié)合類糜蛋白酶。 【結(jié)論】 成功克隆了肥大細胞類糜蛋白酶編碼基因；成功地構(gòu)建了pDES