人肥大細(xì)胞類糜蛋白酶的原核表達(dá)及其多克隆抗體的制備.pdf

1、【目的】 克隆人肥大細(xì)胞類糜蛋白酶(chymase)編碼區(qū)基因(CMA)，并在大腸桿菌中進(jìn)行原核表達(dá)，制備重組類糜蛋白酶，以之為免疫原免疫家兔制備其多克隆抗體，為進(jìn)一步研究類糜蛋白酶的生物學(xué)功能及建立類糜蛋白酶免疫學(xué)檢測方法奠定基礎(chǔ)。 【方法】 (1)通過RT-PCR克隆人肥大細(xì)胞類糜蛋白酶cDNA； (2)采用Gateway技術(shù)構(gòu)建表達(dá)載體pDEST17/CMA； (3)將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌B

2、L21-AI，以L-阿拉伯糖為誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)； (4)利用Ni-NTA 層析柱，采用親和層析法純化重組蛋白； (5)利用純化的重組類糜蛋白酶為免疫原免疫家兔制備多克隆抗體，并以間接ELISA測定抗體效價(jià)，Western blot鑒定抗體的特異性。 【結(jié)果】 (1)通過RT-PCR成功克隆了人肥大細(xì)胞類糜蛋白酶cDNA； (2)利用Gateway 技術(shù)成功地構(gòu)建了類糜蛋白酶表達(dá)載體pDEST

3、17/CMA； (3)在大腸桿菌 BL21-AI中，以 L-阿拉伯糖為誘導(dǎo)劑成功誘導(dǎo)了重組人肥大細(xì)胞類糜蛋白酶的表達(dá)，并采用了親和層析將其純化； (4)利用純化的重組類糜蛋白酶為免疫原免疫家兔，成功制備了兔抗人類糜蛋白酶多克隆抗體，ELISA 結(jié)果顯示效價(jià)大于1:12800，Western blot 分析表明該抗體能特異結(jié)合類糜蛋白酶。 【結(jié)論】 成功克隆了肥大細(xì)胞類糜蛋白酶編碼基因；成功地構(gòu)建了pDES