羥基喜樹堿亞微乳細(xì)胞內(nèi)動(dòng)力學(xué)及其抗腫瘤作用研究.pdf

1、本課題在前期研究基礎(chǔ)上，采用微射流技術(shù)制備了羥基喜樹堿(HPCT)亞微乳，對(duì)HCPT亞微乳的細(xì)胞內(nèi)動(dòng)力學(xué)特征、細(xì)胞器的分布規(guī)律，細(xì)胞攝取機(jī)制和體內(nèi)外抗腫瘤作用進(jìn)行了探討；研究了亞微乳中藥物分布和其藥物釋放，以及HCPT－SAE克服腫瘤細(xì)胞多藥耐藥作用。本研究為亞微乳成為抗腫瘤藥物載體的進(jìn)一步研究開發(fā)提供了理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 本課題首先建立了羥基喜樹堿的HPLC分析方法，測(cè)定其在水和正辛醇中的表觀溶解度分別為2.98和47.06μg

2、/mL，正辛醇，水中的表觀分配系數(shù)為12.62，其脂溶性比水溶性好；考察：HCPT在不同pH條件下的表觀開環(huán)平衡常數(shù)，以及其在多種油中的溶解度，為設(shè)計(jì)處方確定工藝條件及建立體內(nèi)分析方法提供了依據(jù)。 本課題以注射用大豆油、大豆磷脂、十八酰胺或膽固醇和維生素E為油相，Poloxamcrl88或(和)大豆磷脂和甘油為水相，采用微射流技術(shù)制備了兩種HCPT亞微乳(HCPT-SAE和HCFT-LipoE)。HCPT亞微乳理化性質(zhì)研究顯示，

3、HCPT-SAE和HCPT-LipoE經(jīng)高壓滅菌后，外觀、乳滴粒徑、粒徑分布和Zeta電位均未發(fā)生顯著改變；pH值有所下降，但符合注射液質(zhì)量要求;藥物含量略有下降，但仍占標(biāo)示量的96％以上。HCPT亞微乳經(jīng)高壓滅菌后理化性質(zhì)穩(wěn)定。亞微乳中HCPT相分布研究表明，HCPT主要分布于O/W界面層構(gòu)成的界面膜中，占亞微乳中藥物總量80％以上，油相(14％以上)中分布高于水相；體外釋放實(shí)驗(yàn)表明，HCPT-SAE和HCPT-LipoE兩者體外釋放

4、行為相似，釋藥速度較慢，具有緩釋作用，此作用可能與藥物在乳劑中的相分配有關(guān)。穩(wěn)定性研究表明，HCPT亞微乳減慢了其在血漿和細(xì)胞培養(yǎng)液中由內(nèi)酯型向羧酸鹽型的轉(zhuǎn)化速率，增加其以內(nèi)酯形式存的濃度。 采用建立的細(xì)胞內(nèi)．HCPT含量測(cè)定方法，研究HCPT亞微乳細(xì)胞內(nèi)動(dòng)力學(xué)和HCPT在細(xì)胞器的分布。攝取動(dòng)力學(xué)結(jié)果表明，與對(duì)照制劑HCPT-I相比，相同藥物量HCPT亞微乳與細(xì)胞孵育后，能顯著提高細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞核內(nèi)藥物量。 細(xì)胞內(nèi)消除動(dòng)力

5、學(xué)研究表明，在SGC7901細(xì)胞中，HCPT-SAE和HCPT-LipoE的AUC顯著高于HCPT-I(P<0.01)，分別為HCPT-I的9.88和7.69倍；tl/2也顯著比HCPT-I延長(zhǎng)(P<0.01)，分別為HCPT-I的1.67和2.1倍。HCPT亞微乳細(xì)胞核AUC和tl/2均顯著高于HCPT－I(P<0.01)，HCPT－SAE細(xì)胞核AUC比HCPT-LipoE高1.76倍；細(xì)胞質(zhì)中兩亞微乳AUC也均顯著,高于HCPT-I

6、(P<0.01)。兩亞微乳細(xì)胞核AUC均比細(xì)胞質(zhì)低。 SGC7901/CR細(xì)胞中HCPT-SAE和HCPT-LipoE的AUC顯著高于HCPT-I(P<0.01)，分別為HCPT-I的29.16和8.54倍，HCPT-SAE為HCPT-LipoE的3.4l倍；tl/2也顯著比HCPT-I長(zhǎng)(P<0.01)，分別為HCPT-I的5.37和6.23倍。兩亞微乳細(xì)胞核AUC均顯著高于細(xì)胞質(zhì)(P<0.01)，HCPT-LipoE細(xì)胞核內(nèi)tl/2

7、比細(xì)胞質(zhì)顯著延長(zhǎng)(P<0.05)；HCPT-SAE組細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)AUC均顯著比HCPT-LipoE組高(P<0.01)，兩亞微乳細(xì)胞核tl/2無差異，而細(xì)胞質(zhì)中HCPT-SAE比HCPT-LipoE顯著延長(zhǎng)(P<0.05)。 HeLa細(xì)胞中HCPT-SAE和HCPT-LipoE的AUC顯著高于HCPT-I(P<0.01)，分別為HCPT-I的35.26和15.44倍；tl/2也顯著比HCPT-I長(zhǎng)(P<0.05)，分別為HCP

8、T-I的1.67和1.75倍。兩亞微乳細(xì)胞核AUC均顯著高于細(xì)胞質(zhì)(P<0.05)，HCPT-LipoE細(xì)胞核內(nèi)tl/2比細(xì)胞質(zhì)顯著延長(zhǎng)(P<0.05)；HCPT-SAE組細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)AUC均顯著比HCPT-LipoE組高(P<0.01) HCPT亞微乳細(xì)胞攝取機(jī)理研究顯示，在一定濃度范圍內(nèi)，細(xì)胞攝取HCPT量隨HCPT亞微乳濃度升高而增加，表現(xiàn)出明顯的濃度依賴性，高濃度時(shí)則表現(xiàn)為飽和性；細(xì)胞攝取HCPT亞微乳時(shí)呈現(xiàn)明顯的溫度

9、依賴性，該過程需要消耗能量；內(nèi)吞抑制劑(疊氮鈉、甘露醇和氯喹)顯著降低細(xì)胞內(nèi)HCPT聚積。初步證實(shí)，細(xì)胞攝取HCPT亞微乳為能量依賴性的內(nèi)吞方式。 HCPT亞微乳能增強(qiáng)對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用，抑制作用呈時(shí)間和劑量依賴性；HCPT-SAE對(duì)SGC7901、SGC7901/VCR和HeLa細(xì)胞的增殖均有較顯著的抑制作用，HCPT-LipoE和HCPT-I僅對(duì)敏感的細(xì)胞有較強(qiáng)抑制作用，而對(duì)耐藥細(xì)胞(SGC7901/VCR細(xì)胞)的抑制

10、作用很弱。腫瘤細(xì)胞增殖抑制、胞內(nèi)藥物聚積等實(shí)驗(yàn)確證，陽離子亞微乳(HcPT－sAE)可增強(qiáng)藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞抑制增殖作用，克服腫瘤細(xì)胞多藥耐藥性。 體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究結(jié)果表明，HCPT-SAE和HCPT－LipoE可以顯著延長(zhǎng)HCPT的體內(nèi)循環(huán)時(shí)間，提高血漿中藥物濃度，其消除半衰期分別為HCPT-I的5.75和3.72倍，AUC為HCPT-I的4.03和4.01倍。荷S180腫瘤小鼠體內(nèi)分布研究結(jié)果表明，HCPT亞微乳可提高HCPT在腫

11、瘤內(nèi)的分布，HCPT-SAE的腫瘤靶向作用最明顯，其AUC和峰濃度分別為HCPT-l組的11.57和1.9l倍。 HCPT-I的抗腫瘤活性最差，在4 mg/kg時(shí)其抑瘤率為31.03％，同劑量的HCPI-SAE和HCPT-LipoE抑瘤效率分別為90.75％和70.2l％；2 mg/kg的HCPT-SAE的抑瘤率為64.31％，為HCPT-I(4 mg/kg)的兩倍，對(duì)小鼠體重?zé)o顯著影響；腫瘤病理切片顯示，HCPT－SAE對(duì)腫瘤細(xì)胞抑制