轉(zhuǎn)反義B7-1基因治療延長(zhǎng)大鼠肝移植物存活時(shí)間的研究.pdf

1、[研究背景] 終末期肝病為我國的常見病、多發(fā)病。肝臟移植是最佳治療方法乃至唯一選擇。隨著手術(shù)技術(shù)不斷完善，以及免疫抑制劑的應(yīng)用，肝臟移植得到廣泛開展，但肝臟移植后影響器官存活的最大障礙是受體對(duì)移植器官的排斥反應(yīng)。 選擇在肝移植排斥反應(yīng)發(fā)展過程中起重要作用的基因作為靶點(diǎn)，是肝臟移植排斥反應(yīng)轉(zhuǎn)基因治療的關(guān)鍵之一。隨著對(duì)肝臟移植排斥反應(yīng)發(fā)生、發(fā)展分子生物學(xué)機(jī)制的研究深入，已發(fā)現(xiàn)在肝臟移植排斥反應(yīng)的發(fā)病過程中涉及到多個(gè)共刺激分子

2、通路的過度表達(dá)。T細(xì)胞活化需要雙信號(hào)[8,9,10]；第一信號(hào)是TCR識(shí)別APCs上的抗原肽-MHC復(fù)合體，這一信號(hào)決定了T細(xì)胞活化特異性；第二信號(hào)是T細(xì)胞上的CD28與APCs上B7分子的結(jié)合形成的所謂CD28-B7共刺激通路，它對(duì)維持和進(jìn)一步活化T細(xì)胞至關(guān)重要；之后，活化的T細(xì)胞表達(dá)CTIA4分子，CTLA4和CD28都是T細(xì)胞上與B7結(jié)合的同源受體，CTLA4與B7結(jié)合負(fù)調(diào)節(jié)T細(xì)胞的活化[11,12,13]。 [目的]：構(gòu)

3、建能在真核細(xì)胞表達(dá)的含大鼠B7-1反義基因片段的載體，為進(jìn)一步研究B7-1反義基因抑制肝臟移植的排斥作用奠定基礎(chǔ)。 [方法]： 1.設(shè)計(jì)含有Xho I和BamH I酶切位點(diǎn)的一對(duì)引物，通過PCR技術(shù)擴(kuò)增獲取質(zhì)粒載體pcDNA3-B7-1上的目的片段B7-1(426bp)，經(jīng)過純化的B7-1 cDNA和PMD18-T載體經(jīng)過連接，轉(zhuǎn)化，鑒定而得到中間載體質(zhì)粒PMD18-T-B7-1。 2.經(jīng)Xho I和BamH I

4、雙酶切PMDl8-T-B7-1及pcDNA3B(-)真核表達(dá)載體后，使用T4DNA連接酶連接，構(gòu)建反義B7-1表達(dá)載體。 pcDNA3B(-)真核表達(dá)載體的Xho I和BamH I酶切位點(diǎn)與B7-1全基因序列所含酶切位點(diǎn)相反。 3.構(gòu)建好的重組質(zhì)粒采用PCR、酶切及測(cè)序鑒定。 [結(jié)論]： 成功構(gòu)建了大鼠B7-1反義真核表達(dá)載體，為研究器官移植時(shí)阻斷B7-1/CD28共刺激通路抑制排斥反應(yīng)的發(fā)生奠定了基礎(chǔ)。

5、 [研究背景] 肝臟移植是治療終末期肝病的最佳方法乃至唯一的選擇。決定肝臟移植成敗的關(guān)鍵問題之一是受體對(duì)移植器官的排斥反應(yīng)，受體對(duì)移植器官的排異反應(yīng)根源于T淋巴細(xì)胞的激活和增生。 所有的B7樣分子和它們的受體都是I型跨膜糖蛋白，屬于免疫球蛋白超家族。 B7家族各成員之間有20％-35％氨基酸序列是相同的。B7-1(CD80)和B7-2(CD86)是研究的最廣泛的T細(xì)胞協(xié)同刺激分子，二者分別結(jié)合的受體包括C

6、D28、CTLA-4、ICOS、PD-1(程序性死亡分子)和BTLA(B、T細(xì)胞弱化因子)。所有這些協(xié)同信號(hào)分子不僅提供促進(jìn)T細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和產(chǎn)生細(xì)胞因子的正向信號(hào)(CD28和ICOS)，同時(shí)還能通過提供負(fù)向信號(hào)來限制、終止和/或減弱T細(xì)胞應(yīng)答(CTLA-4、PD-1和BTLA)。改變這些協(xié)同分子的表達(dá)可以調(diào)控免疫反應(yīng)的強(qiáng)度和方向。 本實(shí)驗(yàn)利用反義B7-1于體外冷保存期間轉(zhuǎn)染供肝，對(duì)介導(dǎo)大鼠原位肝移植(ROLT)急性排斥反應(yīng)起關(guān)

7、鍵作用的第二信號(hào)進(jìn)行阻斷，應(yīng)用Wester blot和熒光免疫組織化學(xué)技術(shù)分別檢測(cè)B7-1蛋白的表達(dá)情況，觀察反義B7-1對(duì)供體肝細(xì)胞共刺激分子B7-1表達(dá)的抑制作用。 [目的]：建立大鼠原位肝移植(ROLT)急性排斥反應(yīng)模型，觀察應(yīng)用反義B7-1在大鼠肝移植術(shù)后對(duì)共刺激分子B7-1和CD4/CD8T細(xì)胞的影響及其抗排斥反應(yīng)的作用，探討反義B7-1療法在對(duì)抗急性排斥反應(yīng)中的作用。 [方法]： 1.雄性近交系DA大

8、鼠120只，購自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體重160-200g；雄性近交系Lewis大鼠120只，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司.體重180-200g；pcDNA3B-B7-1反義真核表達(dá)質(zhì)粒為自己構(gòu)建。 2.采用"二袖套管"法，建立DA→Lewis大鼠配對(duì)組合的ROLT急性排斥反應(yīng)模型，動(dòng)物術(shù)前12h禁食不禁水。凡ROLT術(shù)后存活48h以上者納入本研究，并按隨機(jī)表法分為2組。A組：對(duì)照組(n=60)：DA→Lewis RO

9、LT模型，供肝冷保存期間門靜脈注射生理鹽水1ml，冷保存一個(gè)小時(shí)，共分為移植術(shù)后1,2,3,4,5d組及生存情況觀察組6組，每組10只大鼠；B組： pcDNA3B-B7-1/Lipofectamine2000組(n=60)：DA→Lewis ROLT模型，供肝冷保存期間門靜脈注射pcDNA3B-B7-1 100μg，只大鼠，同樣分為6組。然后2組動(dòng)物分別于移植術(shù)后1,2,3,4,5d處死收集肝臟標(biāo)本。 3.一般情況觀察觀

10、察2組受體鼠術(shù)后的精神狀態(tài)、運(yùn)動(dòng)、食欲、耳廓和皮膚黃染程度，以及小便顏色。 4.Western blot半定量：提取組織標(biāo)本總蛋白，以β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)為內(nèi)參,檢測(cè)B7-1蛋白的表達(dá)。 5.肝移植急性排斥反應(yīng)的組織病理學(xué)診斷，按Banff系統(tǒng)將急性排斥的程度進(jìn)行評(píng)分，確定排斥活動(dòng)性指數(shù)(Rejectiona ctivity index,RAI)。 6.免疫組化：應(yīng)用免疫組織化學(xué)SABC法(免疫熒光)，

11、檢測(cè)肝臟組織中B7-1蛋白表達(dá)情況，檢測(cè)CD4、CD8 T細(xì)胞的浸潤情況，分析CD4、CD8 T細(xì)胞的浸潤與肝移植急性排斥反應(yīng)的關(guān)系。 7.觀察試驗(yàn)組和對(duì)照組大鼠的長(zhǎng)期生存情況，并進(jìn)行Log-rank生存分析。 [結(jié)論]： 1.B7-1/CD28共刺激通路成為抑制肝移植急性排斥反應(yīng)的新靶點(diǎn)。 2.肝竇內(nèi)皮細(xì)胞作為抗原遞呈細(xì)胞其共刺激分子B7-1的表達(dá)明顯上調(diào)；具有誘導(dǎo)CD4、CD8 T細(xì)胞向大鼠肝臟浸潤的

12、作用。 3.應(yīng)用反義B7-1可以降低移植肝組織中B711的表達(dá)，降低了肝竇內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)CD4、CD8 T細(xì)胞的誘導(dǎo)作用，有效抑制急性排異反應(yīng)。 4.反義基因技術(shù)局部應(yīng)用能夠影響靶基因的表達(dá)，抑制其功能。反義基因技術(shù)將成為肝臟移植控制排斥反應(yīng)研究的新方向。 [研究背景] 肝內(nèi)膽管結(jié)石在東南亞尤其是中國為常見病和多發(fā)病，是良性肝門膽管狹窄的主要病因[1,2]。肝內(nèi)膽管結(jié)石的手術(shù)要點(diǎn)是去除肝內(nèi)外膽管中的結(jié)石、狹窄

13、及感染灶，必要時(shí)可行肝葉部分切除術(shù)，形成通暢的管道。通常采用Roux-en-Y型膽管空腸吻合(Roux-en-Y hepaticojejunostomy，RYHJ)進(jìn)行外科治療[3,4]。然而采用RYHJ的遠(yuǎn)期療效并不令人滿意。這類手術(shù)廢棄了肝外膽道及Oddi括約肌的生理功能，帶來的膽汁流向的改變和消化道的改建，并且腸內(nèi)容物和活化胰液的反流，使得反流性膽管炎及膽管結(jié)石復(fù)發(fā)不可避免。[5,6,7,8,9,10]在一宗314例肝內(nèi)膽管結(jié)石治

14、療的回顧性研究中表明，RYHJ的遠(yuǎn)期結(jié)石的發(fā)生率和膽管炎的復(fù)發(fā)率為22.0％[11]。Bismuth H的研究表明，RYHJ的復(fù)發(fā)性膽管炎的發(fā)生率為10-15％[12]。十二指腸乳頭括約肌能夠維持正常的膽道內(nèi)壓，因而能夠預(yù)防細(xì)菌的反流。細(xì)菌感染是膽管內(nèi)棕色結(jié)石形成的重要原因，一方面許多細(xì)菌可以分泌外源性β-葡萄糖醛酸酐酶(β-G)[13,14]，該酶可以裂解結(jié)合膽紅素為非結(jié)合膽紅素，與鈣結(jié)合形成膽紅素鈣沉淀。另一方面在膽道產(chǎn)生大量粘泥，

15、主要成分是多糖蛋白質(zhì)復(fù)合物，它們?cè)谀懝芙Y(jié)石形成和發(fā)展以及膽管的阻塞中都起到了非常重要的作用[15]。由于RYHJ的明顯缺陷，Li等[11]提出應(yīng)該慎重考慮RYHJ的適應(yīng)癥，該術(shù)式適用于合并先天性膽管擴(kuò)張或并發(fā)乳頭括約肌功能失調(diào)的病人。為了保存膽道的生理功能，自1997年我們采用帶血管蒂的膽囊瓣來修復(fù)肝門膽管狹窄與缺損(hepatic portal choledochoplasty with a pedicled graft of gal

16、lbladder，HPC)并同時(shí)應(yīng)用常規(guī)RYHJ方法。我們回顧性分析了1997年以來接受這兩種術(shù)式的病人資料，探討HPC對(duì)良性肝門膽管狹窄的治療效果。 [目的]：肝內(nèi)膽管結(jié)石合并肝門膽管狹窄通常采用RYHJ進(jìn)行外科治療，使得反流性膽管炎及膽管結(jié)石復(fù)發(fā)不可避免。我們采用改良的帶血管蒂膽囊瓣肝門膽管成形術(shù)(HPC)治療良性肝門膽管狹窄并探討其治療效果。 [方法]： 1.病例選擇：1997年1月-2006年1月，10年

17、間在我院因肝內(nèi)膽管結(jié)石伴肝門膽管炎性狹窄行HPC或RYHJ獲得隨訪的患者共149例，且滿足以下條件：(1)所有研究對(duì)象均經(jīng)B超、CT及/或ERCP確診為肝內(nèi)膽管結(jié)石并肝門膽管狹窄。(2)術(shù)中膽道鏡檢查及術(shù)后B超檢查或拔除T管前行膽道造影證實(shí)無膽道殘石。根據(jù)手術(shù)方式不同分HPC組和RYHJ組。 2.對(duì)兩組病人資料進(jìn)行均衡性檢驗(yàn)，觀察他們的圍手術(shù)期安全性和術(shù)后膽管炎的發(fā)生、結(jié)石復(fù)發(fā)的情況。 [結(jié)論]： 1.HPC手術(shù)