EV71 3D真核表達(dá)載體構(gòu)建及相互作用蛋白篩選的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：腸道病毒71型(Enterovirus71，EV71)是手足口病的主要病原體之一。為深入研究EV713D聚合酶的功能及作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建EV713D真核表達(dá)載體并利用串聯(lián)親和純化技術(shù)篩選與EV713D聚合酶相互作用的宿主蛋白。
　　方法：擴(kuò)增EV71 BrCr株病毒并提取RNA。利用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法從EV71 BrCr株全基因組中獲得3D聚合酶基因，經(jīng)BamH/EcoRⅠ雙酶切，插入真核表達(dá)載體pc

2、DNA3.0-Flag-HA多克隆位點(diǎn)BamHⅠ/EcoRⅠ之間，構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA3.0-3D-Flag-HA。經(jīng)酶切驗(yàn)證及測(cè)序鑒定后，將構(gòu)建成功的真核表達(dá)載體pcDNA3.0-3D-Flag-HA轉(zhuǎn)染RD細(xì)胞。用免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)重組載體轉(zhuǎn)染效率，Western blot方法檢測(cè)3D聚合酶在RD細(xì)胞中的表達(dá)。通過串聯(lián)親和純化技術(shù)富集到與3D聚合酶相互作用的宿主蛋白并進(jìn)行液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)分析，經(jīng)NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索篩

3、選與3D聚合酶相互作用的蛋白或多肽。采用免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)和熒光共定位技術(shù)，對(duì)候選蛋白與3D聚合酶的相互作用進(jìn)行驗(yàn)證。
　　結(jié)果：構(gòu)建EV713D真核表達(dá)載體pcDNA3.0-3D-Flag-HA后，分別將未經(jīng)酶切的重組質(zhì)粒和重組質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，后者出現(xiàn)約1.4Kbp和5.5Kbp兩個(gè)條帶，分別與3D基因和pcDNA3.0-Flag-HA大片段的大小相符。初步證明重組質(zhì)粒pcDNA3.0-3D-Flag-HA構(gòu)建正確

4、。將測(cè)序結(jié)果與GeneBank中檢索到的EV71 BrCr株基因序列(序列號(hào)AB204853.1)進(jìn)行比對(duì)，證實(shí)3D基因已成功克隆到pcDNA3.0-Flag-HA載體中。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染RD細(xì)胞后，免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染RD細(xì)胞效率約為30％，Western blot檢測(cè)到轉(zhuǎn)染后RD細(xì)胞中有3D聚合酶的表達(dá)。經(jīng)串聯(lián)親和純化和LC-MS分析，并進(jìn)行NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，篩選出細(xì)胞周期素G1(Cyclin G1)等一系列與3D聚合酶