ATF3在腸癌細(xì)胞HCT116中生物學(xué)作用及蛋白酶體抑制劑Carfilzomib對ATF3的調(diào)節(jié).pdf

1、目的：全球范圍內(nèi)，結(jié)直腸癌致死位居腫瘤死因第四位，盡管如今結(jié)直腸癌的診斷以及治療水平有所提高，其5年生存率也只有53.8-65.2％。ATF3蛋白屬于ATF/CREB轉(zhuǎn)錄因子家族成員具有堿性亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)（bZip）,作為一種轉(zhuǎn)錄活化因子在腫瘤中起著致癌基因還是抑癌基因作用存在爭論。本研究通過慢病毒介導(dǎo)ATF3在結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116中過表達(dá)，探討ATF3在HCT116細(xì)胞中對其增殖、腫瘤起始能力、轉(zhuǎn)移侵襲以及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）生

2、物學(xué)作用，并初步探討可能的分子機(jī)制,探討蛋白酶體抑制劑Carfilzomib對HCT116的細(xì)胞毒作用以及對ATF3的調(diào)節(jié)。
　　方法：構(gòu)建慢病毒介導(dǎo)的ATF3表達(dá)載體并感染HCT116，puro篩選出穩(wěn)定ATF3過表達(dá)的HCT116細(xì)胞株HCT116/ATF3和陰性對照HCT116/Control。應(yīng)用MTS細(xì)胞活性分析、FACS細(xì)胞周期檢測、FACSAnexinⅤ-7-AAD、克隆形成實驗來檢測細(xì)胞增殖能力；應(yīng)用細(xì)胞球囊形成實

3、驗以及FACS檢測細(xì)胞腫瘤起始能力；應(yīng)用劃痕實驗、Transwell轉(zhuǎn)移分析和Transwell侵襲分析來檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)移侵襲能力；應(yīng)用光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化鑒定細(xì)胞EM T；用Western Bloting和real-time qPCR來檢測相關(guān)基因的mRNA及蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果：MTS細(xì)胞活性檢測增殖能力以及克隆形成實驗克隆數(shù)在HCT116/ATF3細(xì)胞明顯低于對照細(xì)胞HCT116/Control（p<0.05）；rea

4、l-time qPCR和Western Blot檢測到HCT116/ATF3細(xì)胞survivin、cyclinD1、PCNA表達(dá)下調(diào)以及PARP表達(dá)上調(diào)。HCT116/ATF3細(xì)胞形成的細(xì)胞球囊平均直徑和數(shù)量以及CD133+CD24+細(xì)胞群的百分比明顯低于對照細(xì)胞（p<0.05）；qRT-PCR和Western Bloting檢測到HCT116/ATF3細(xì)胞CD133、CD24、Ep-CAM、CD166、ID1、beta-catenin

5、和EZH2表達(dá)下調(diào)。HCT116/ATF3細(xì)胞創(chuàng)傷愈合劃痕實驗創(chuàng)傷愈合程度、Transwell遷移分析與Transwell侵襲實驗的細(xì)胞穿過數(shù)明顯低于對照細(xì)胞（p<0.05）；real-time qPCR和Western Blot檢測到HCT116/ATF3細(xì)胞MMP2和MMP9表達(dá)下調(diào)以及TIMP2和TIMP1表達(dá)上調(diào)。光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)HCT116/ATF3細(xì)胞形態(tài)由間質(zhì)細(xì)胞向上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化（MET）；Western Blot檢測

6、到HCT116/ATF3細(xì)胞E-cadherin表達(dá)上調(diào)和snail、slug和twist表達(dá)下調(diào)。通過MTS細(xì)胞活性檢測HCT116生長隨Carfilzomib劑量增加而受到抑制，細(xì)胞周期檢測Carfilzomib作用后HCT116主要停滯在G0/G1期；FACSAnexinⅤ-7-AAD檢測HCT116凋亡隨Carfilzomib劑量增加而增加。通過real-time qPC R和Western Blot檢測到Carfilzomib

7、誘導(dǎo)ATF3表達(dá)具有時間依賴性。
　　結(jié)論：應(yīng)用慢病毒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染成功構(gòu)建ATF3穩(wěn)定表達(dá)HCT116細(xì)胞模型HCT116/ATF3和對照細(xì)胞HCT116/Control；ATF3通過下調(diào)survivin、cyclinD1、PCNA以及上調(diào)PARP來抑制HCT116細(xì)胞增殖；ATF3通過下調(diào)CD133、CD24、Ep-CAM、CD166、ID1、beta-catenin和EZH2來抑制HCT116腫瘤起始能力；ATF3通過下調(diào)MM