蛋白酶體抑制劑在ARPE-19細(xì)胞中抗炎、抗氧化損傷機(jī)制的研究.pdf

1、答辯委員會(huì)主席：量萄垂墊煎(哇叢太堂)答辯委員會(huì)成員2噬齜絲墊!暹糾匹膨魔)論文答辯日期：2013512溫州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文蛋白酶體抑制劑在ARPE19細(xì)胞中抗炎、抗氧化損傷機(jī)制的研究摘要目的年齡相關(guān)性黃斑變性(agerelatedmaculardegeneration，AMD)中慢性炎癥、氧化性刺激對(duì)RPE細(xì)胞、視錐、視桿細(xì)胞的死亡起重要的誘導(dǎo)作用。有研究表明，在小鼠新皮質(zhì)神經(jīng)元中，低濃度的蛋白酶體抑制劑能升高蛋白酶體活性從而減少了

2、神經(jīng)退行性疾病中細(xì)胞的死亡。本課題研究可逆性蛋白酶體抑制劑CarbobenzoxyL—leucylLleucylLleucinal(MG132)和不可逆性蛋白酶體抑制劑clasto1actacystinplactone(LA)在ARPE一19細(xì)胞中的抗炎、抗氧化損傷作用，并探討它們的作用機(jī)制。方法1、細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)蛋白酶體抑制劑的抗氧化損傷作用ARPE一19細(xì)胞先用不同濃度的MG一132或LA預(yù)處理，再用氧化性刺激物4hydroxyn

3、onenal(4一HNE)／menadione(VK3)處理，加MTS檢測(cè)吸光度。2、蛋白酶體活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)ARPE19細(xì)胞用不同濃度的MG一132或LA分別處理，后用非變性細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，收集蛋白。在Ex380nm，Em440nm下檢測(cè)熒光值，用熒光值表示蛋白酶體的活性。3、蛋白酶體抑制劑激活轉(zhuǎn)錄因子peroxisomeproliferatoractivatedreceptor(PVAW)(1)細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)ARPE一19細(xì)胞先用MG

4、一132和不同濃度的PPARct／PPAR抑制劑GW6471／GW9662預(yù)處理，再用4HNE／VK3處理，加MTS檢測(cè)吸光度。(2)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)ARPE一19細(xì)胞中共同轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pPPREx3tl(一Luc和pRL—SV40，后用不同濃度MG132和LA分別處理細(xì)胞，檢測(cè)螢火蟲(chóng)熒光素酶和海腎熒光素酶的活性，用兩者比值來(lái)反映啟動(dòng)子PPAR反應(yīng)元件(PPARresponseelement，PPRE)的活性。(3)電泳遷移率實(shí)驗(yàn)(e