傷寒沙門菌mig-14基因功能研究.pdf

1、目的: Mig-14是傷寒沙門菌的一種內(nèi)膜結(jié)合蛋白，在高滲應激時期表達顯著增高，蛋白結(jié)構(gòu)分析提示它可能為一種調(diào)節(jié)蛋白。本研究目的是揭示傷寒沙門菌Mig-14在高滲應激下對基因表達的調(diào)節(jié)作用。 方法: 1．用自殺質(zhì)粒介導的同源重組方法，制備傷寒沙門菌mig-14基因缺陷變異株。根據(jù)傷寒沙門菌mig-14基因序列，設(shè)計PCR特異性引物，并在引物5’末端加上需要的酶切位點。擴增mig-14基因上、下游DNA片段，用Bg

2、lⅡ消化后，定向連接成mig-14基因的缺損性同源性核苷酸片段。將此片段膠回收后克隆至自殺質(zhì)粒pGMB151的BamHI位點，再將經(jīng)酶切和特異性PCR鑒定的陽性重組自殺質(zhì)粒用電擊法導入傷寒沙門菌野生株，用蔗糖誘導同源重組。用PCR觀察重組現(xiàn)象，將完全重組的菌株作為mig-14基因缺陷變異株，并通過相應的核苷酸序列分析加以確證。 2．利用傷寒沙門菌全基因組芯片分析技術(shù)，在體外模擬高滲應激環(huán)境，向在低滲培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長期的菌液

3、中加入NaCl，使其濃度從50mM增加到300mM。在高滲應激早期(30min)分別提取傷寒沙門菌野生株和mig-14基因缺陷變異株總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA并加標熒光(cy3或cy5)，與基因組芯片進行雜交，掃描分析，比較傷寒沙門菌野生株和mig-14基因缺陷變異株在高滲應激早期的基因表達譜差異，并選擇部分差異表達基因利用實時熒光定量RT—PCR驗證，以分析Mig-14在高滲應激下對基因表達的調(diào)節(jié)作用。 3．在中性和酸性條件下

4、對mig-14缺陷株、phoP缺陷株和野生株做多粘菌素B殺傷實驗，以確證在S．TyphiGIFU10007野生株中mig-14是否能拮抗多粘菌素B的殺傷作用。 結(jié)果: 1．成功制備傷寒沙門菌mig-14缺陷株，經(jīng)PCR及序列分析證實，mig-14變異株中mig-14基因的編碼區(qū)有390個堿基缺失，且沒有發(fā)生極性突變。 2．基因表達譜比較分析結(jié)果表明，在高滲應激早期mig-14變異株與野生株相比有77個基因表達下調(diào)

5、和72個基因表達上調(diào)，其中包括鞭毛蛋白、侵襲蛋白、外膜蛋白、代謝酶類以及一些未知功能的蛋白。選取其中部份差異表達基因cydA、invF、pagP和treC，利用實時熒光定量RT—PCR進行驗證，結(jié)果顯示所選基因的mRNA水平與基因芯片分析的結(jié)果情況一致。 3．在中性培養(yǎng)基條件下，多粘菌素B對三種菌株的殺傷效果基本相同。在酸性條件下mig-14缺陷株確實對多粘菌素B的敏感性比野生株稍高，但敏感程度比phoP缺陷株低很多。