傷寒沙門菌雙組份調(diào)控系統(tǒng)QseBC相關(guān)功能研究.pdf

1、目的:
　　傷寒沙門菌QseBC雙組份調(diào)控系統(tǒng)是重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因調(diào)節(jié)系統(tǒng)，通過感應(yīng)信號(hào)分子調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)。在大腸桿菌和鼠傷寒沙門菌中，QseBC雙組份調(diào)控系統(tǒng)已被證實(shí)在細(xì)菌毒力調(diào)控方面發(fā)揮重要作用。本論文旨在研究傷寒沙門菌QseBC雙組份調(diào)控系統(tǒng)對(duì)細(xì)菌動(dòng)力和生物膜等毒力相關(guān)調(diào)節(jié)作用以及探討可能的調(diào)控機(jī)制。
　　方法:
　　1.qseB高表達(dá)株的構(gòu)建:利用pBAD/gⅢ質(zhì)粒構(gòu)建重組載體pBAD-qseB，電轉(zhuǎn)入傷

2、寒沙門菌野生株，構(gòu)建qseB高表達(dá)株。
　　2.動(dòng)力試驗(yàn):在0.3％瓊脂糖的LB半固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)菌，觀察野生株、QseBC系統(tǒng)缺陷株及回補(bǔ)株、qseB高表達(dá)株及空載體對(duì)照株的動(dòng)力情況。
　　3.生物膜試驗(yàn):用剛果紅試驗(yàn)和生物膜結(jié)晶紫染色試驗(yàn)比較野生株、QseBC系統(tǒng)缺陷株、qseB高表達(dá)株及空載體對(duì)照株的生物膜形成情況。
　　4.實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR):Trizol法提取總RNA，利用特異性引物逆轉(zhuǎn)錄

3、的方法定量檢測野生株、QseBC系統(tǒng)缺陷株、qseB高表達(dá)株及空載體對(duì)照株動(dòng)力和生物膜相關(guān)基因的表達(dá)差異。
　　5.鞭毛蛋白FljB∶z66的表達(dá)和分泌檢測:利用westen blot分別檢測對(duì)數(shù)生長期和穩(wěn)態(tài)期中野生株與QseBC系統(tǒng)缺陷株中鞭毛蛋白FljB∶z66的表達(dá)和分泌水平。
　　6.細(xì)菌侵襲力試驗(yàn):將對(duì)數(shù)生長期的野生株與QseBC缺陷株以MOI為20加入有HeLa細(xì)胞的24孔板中。培養(yǎng)90 min后一部分細(xì)胞裂解、

4、涂LB平板、培養(yǎng)過夜，菌落數(shù)T0表示細(xì)菌粘附水平;另一部分加慶大霉素繼續(xù)培養(yǎng)90 min以殺滅胞外細(xì)菌，再用裂解、涂板過夜培養(yǎng)，菌落數(shù)T90表示細(xì)菌侵襲水平。以T90/T0的值表示細(xì)菌侵襲力。
　　7.凝膠阻滯試驗(yàn):用原核表達(dá)并純化的QseBhis6蛋白與含flhD、invF和steABC的啟動(dòng)子區(qū)DNA片段進(jìn)行孵育，再以6％聚丙烯酰胺膠電泳觀察QseB蛋白與相應(yīng)DNA的結(jié)合。
　　結(jié)果:
　　1.qseB高表達(dá)菌株構(gòu)

5、建:經(jīng)酶切、PCR驗(yàn)證及測序分析結(jié)果顯示，成功構(gòu)建pBAD-qseB陽性重組載體，并將其成功導(dǎo)入野生株中，制備成qseB高表達(dá)菌株。
　　2.動(dòng)力試驗(yàn):結(jié)果顯示，與野生株相比，qseB基因缺陷株動(dòng)力無明顯差異，qseC基因缺陷株動(dòng)力明顯下降，qseC基因回補(bǔ)后動(dòng)力有所恢復(fù);與空載體對(duì)照株相比，qseB高表達(dá)株動(dòng)力有所下降。
　　3.生物膜試驗(yàn):剛果紅試驗(yàn)和生物膜結(jié)晶紫染色試驗(yàn)結(jié)果顯示，△qseB、△qseC形成生物膜能力弱于

6、野生株，回補(bǔ)株則有回復(fù)野生株的趨勢;qseB高表達(dá)株生物膜形成能力有所增強(qiáng)。
　　4.實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR):結(jié)果顯示，在△qseC中，qseB基因高表達(dá);一級(jí)鞭毛基因flhDC在△qseC與qseB高表達(dá)株中均下調(diào);生物膜形成相關(guān)基因中，csgD、fimA在△qseC表達(dá)下調(diào)，而pilP、stcB和stgD在qseB高表達(dá)株中表達(dá)明顯上調(diào)。
　　5.鞭毛蛋白FljB∶z66的表達(dá)和分泌檢測:結(jié)果顯示，對(duì)數(shù)生長

7、期和穩(wěn)態(tài)期中野生株與QseBC系統(tǒng)缺陷株中鞭毛蛋白FljB∶z66的表達(dá)和分泌水平均無明顯差異。
　　6.細(xì)菌侵襲試驗(yàn):結(jié)果顯示，與野生株相比，qseC基因缺陷株的對(duì)HeLa細(xì)胞的侵襲力有所下降，而△qseB的侵襲力有所上升。
　　7.凝膠阻滯實(shí)驗(yàn):結(jié)果顯示，QseB與flhD、 invF和stcABC的啟動(dòng)子區(qū)DNA片段無明顯直接結(jié)合跡象。
　　結(jié)論:
　　傷寒沙門菌中QseBC對(duì)動(dòng)力、生物膜形成以及侵襲力都有