力學(xué)應(yīng)變對去勢骨質(zhì)疏松大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化能力的影響.pdf

1、力學(xué)負(fù)荷可促進(jìn)骨組織生長發(fā)育，維持骨結(jié)構(gòu)的完整性和功能。長期以來已經(jīng)認(rèn)識(shí)到力學(xué)負(fù)荷在骨質(zhì)疏松的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要的作用。大量流行病學(xué)證據(jù)提出，體育鍛煉有利于提高峰值骨量和增加骨的強(qiáng)度和彈性，延遲骨質(zhì)疏松的進(jìn)展和預(yù)防骨質(zhì)疏松性骨量丟失和骨折。骨質(zhì)疏松是一種全身性的、代謝性的骨骼系統(tǒng)疾病。由于成骨細(xì)胞的功能活性降低和破骨細(xì)胞的功能活性增高，致使骨形成和骨吸收失平衡，導(dǎo)致凈骨量丟失，易于骨折。成骨細(xì)胞來源于多潛能骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Mese

2、nchymal stem cells,MSCs)。成骨細(xì)胞功能活性的改變除了與成骨細(xì)胞數(shù)量、成骨細(xì)胞本身存活期有關(guān)外，其前體成骨細(xì)胞數(shù)量與功能活性也起到重要作用。MSCs具有干細(xì)胞的共性，即具有自我復(fù)制和多向分化能力，體外不同誘導(dǎo)條件下，能夠向成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、肌腱細(xì)胞、脂肪細(xì)胞及基質(zhì)細(xì)胞等不同的細(xì)胞系分化。 近期有研究發(fā)現(xiàn)骨質(zhì)疏松癥引起的骨量減少往往與骨髓中的脂肪組織增多相伴行，但是有關(guān)細(xì)胞學(xué)機(jī)制還不十分清楚。我們近期的

3、研究也發(fā)現(xiàn)，在大鼠骨質(zhì)疏松模型中，MSC<,s>的成骨分化能力降低，成脂分化能力明顯增高。目前，有關(guān)骨細(xì)胞與力學(xué)作用的實(shí)驗(yàn)研究，多采用原代成骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞株等進(jìn)行。而有關(guān)力學(xué)應(yīng)變對成骨細(xì)胞前體細(xì)胞一MSC<,s>作用的研究較少，尚未見有關(guān)力學(xué)應(yīng)變對骨質(zhì)疏松大鼠MSC<,s>成骨分化能力影響的相關(guān)研究報(bào)道。因此，我們假設(shè)力學(xué)應(yīng)變可以促進(jìn)MSC<,s>的成骨分化能力，抑制其成脂分化能力。本研究的目的就是觀察力學(xué)應(yīng)變對去勢骨質(zhì)疏松(去卵巢和

4、去睪丸)大鼠與正常大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響，為骨質(zhì)疏松癥發(fā)生的細(xì)胞學(xué)機(jī)制提供新的佐證。 選用健康6月齡Sprague-Dawley(SD)大鼠，采用雙側(cè)卵巢或者雙側(cè)睪丸切除術(shù)，建立骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分成4組：雌性對照組(Control-1)、卵巢切除組(OVX)、雄性對照組(Control-2)、睪丸切除組(ORX)。手術(shù)后3個(gè)月，檢測動(dòng)物體重、子宮及睪丸重量；做骨組織形態(tài)學(xué)切片，觀察骨組織形態(tài)和骨細(xì)胞功能活性

5、的變化，以確定模型建立成功。采用密度梯度離心法獲取大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面抗原CD44／CD45分子的表達(dá)。采用本室自制的雙軸力學(xué)應(yīng)變加載系統(tǒng)對細(xì)胞施加大小為4000／μstrain，頻率為1赫茲的力學(xué)應(yīng)變。每天加載3次，每次2小時(shí)，間隔2小時(shí)。力學(xué)實(shí)驗(yàn)分為：(1)加力1天組：用該系統(tǒng)加力1天；(2)靜態(tài)培養(yǎng)1天組：不加力學(xué)應(yīng)變，與(1)培養(yǎng)相同時(shí)間；(3)

6、加力3天組：用該系統(tǒng)加力3天；(4)靜態(tài)培養(yǎng)3天組：不加力學(xué)應(yīng)變，與(3)培養(yǎng)相同時(shí)間。以靜態(tài)培養(yǎng)的細(xì)胞為對照組，受力學(xué)應(yīng)變的細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組，并進(jìn)行比較。經(jīng)力學(xué)應(yīng)變作用后，用RT-PCR的方法檢測MSCs向成骨細(xì)胞分化的標(biāo)志物骨橋蛋白(OPN)、堿性磷酸酶(ALP)、骨鈣素(OCN)、Ⅰ型膠原(Col Ⅰ)、核心編碼因a(Cbfal)及向脂肪細(xì)胞分化的標(biāo)志物脂蛋白脂酶(LPL)表達(dá)水平。用流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞的增殖情況。用熒光染色檢測各

7、組細(xì)胞的細(xì)胞骨架變化。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：1) 去卵巢或者睪丸手術(shù)后，OVX組和ORX組大鼠體重明顯增加(p<0.01)；子宮明顯萎縮，重量降低(p<0.01)；骨組織形態(tài)學(xué)切片顯示骨小梁分離、斷裂，數(shù)量減少，骨髓腔內(nèi)含有大量脂肪細(xì)胞，骨膠原中有大量新生膠原纖維形成，破骨細(xì)胞骨吸收殘跡明顯增加，Ⅰ型膠原表達(dá)量明顯增高。2) MSCs傳至三代呈均一長梭形，沒有雜細(xì)胞；流式細(xì)胞儀檢測MSCs細(xì)胞表面抗原分子CD44陽性，CD45陰性。

8、3) 經(jīng)力學(xué)應(yīng)變刺激后，正常大鼠MSCs的ALP、Cbfa 1和OPN在加力組表達(dá)較相應(yīng)的靜態(tài)組都有升高(p<0.05)，在加力3天組達(dá)到最高(p<0.05)，骨質(zhì)疏松大鼠MSCs的ALP、Cbfal和OPN較相應(yīng)的靜態(tài)組也有升高(p<0.05)，正常大鼠MSCs組升高的較明顯(p<0.05)；OCN在各組MSCs中的表達(dá)變化都不是很明顯(p>0.05)；COL Ⅰ在正常大鼠MSCs組加力3天后表達(dá)升高(p<0.05)其他組沒有變化(p

9、>0.05)；LPL只在骨質(zhì)疏松組靜態(tài)培養(yǎng)3天后有少量表達(dá)，加力后，表達(dá)減少(p<0.05)。4)經(jīng)力學(xué)應(yīng)變作用后，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期，計(jì)算出細(xì)胞增殖指數(shù)。正常大鼠MSCs的PI值在靜態(tài)時(shí)較骨質(zhì)疏松MSCs組高(p<0.05)，加力后，正常大鼠MSCs的PI值與其相應(yīng)的對照組比較升高(p<0.05)，骨質(zhì)疏松大鼠MSCs的PI值與其相應(yīng)的對照組比較升高(p<0.05)，但是正常組升高的較明顯(p<0.05)．加力3天后，正常大鼠M

10、SCs的PI值達(dá)到最高。5)靜態(tài)組骨髓問充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)F-actin呈散在分布，僅有少量的伸長的F-actin微絲，正常組與骨質(zhì)疏松組沒有差異。力學(xué)應(yīng)變刺激一天后，正常組和骨質(zhì)疏松組的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)的F-actin微絲，均較靜態(tài)組增多，熒光增強(qiáng)，正常組較骨質(zhì)疏松組明顯。加力3天后，這種情況更加明顯，兩組細(xì)胞內(nèi)的F-actin微絲增多，熒光增強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示： 1)雙側(cè)卵巢或睪丸切除后3個(gè)月，OVX組和ORX組大鼠體重明顯增加、子宮重量

11、明顯降低；骨小梁斷裂、分離，髓腔內(nèi)大量脂肪細(xì)胞，破骨細(xì)胞骨吸收殘跡明顯增加，I型膠原表達(dá)量明顯增多，均符合絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的特點(diǎn)，說明模型建立成功。2)MSCs表面分子呈現(xiàn)均一的CD44陽性，CD45陰性，表明我們采用密度梯度離心法，通過傳代，可以獲得相對純化的MSCs。3)力學(xué)應(yīng)變作用可促使MSCs向成骨細(xì)胞分化，骨質(zhì)疏松大鼠MSCs向成骨細(xì)胞分化能力下降。力學(xué)應(yīng)變刺激可以調(diào)控MSCs的分化方向，可以使MSCs向成骨細(xì)胞分化增強(qiáng)，向脂肪