轉(zhuǎn)基因三倍體毛白楊外源基因及其表達(dá)的檢測(cè).pdf

1、三倍體毛白楊是近年來(lái)中國(guó)大力推廣的速生樹(shù)種之一.隨著栽培面積的不斷擴(kuò)大,多種食葉害蟲的危害越來(lái)越嚴(yán)重.利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育抗蟲楊樹(shù)新品種已成為當(dāng)前植物遺傳改良的重要手段.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)林業(yè)生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)將構(gòu)建在一個(gè)載體上的雙抗蟲基因(BtCrylAc基因和API基因)對(duì)三倍體毛白楊進(jìn)行了遺傳轉(zhuǎn)化,該研究主要從分子生物學(xué)檢測(cè)、外源基因表達(dá)的檢測(cè)、外源基因表達(dá)規(guī)律及相互關(guān)系、工程農(nóng)桿菌安全性這五個(gè)方面對(duì)轉(zhuǎn)基因三倍體毛白楊進(jìn)行了分析,以期獲得

2、轉(zhuǎn)雙抗蟲基因三倍體毛白楊高抗株系.1根據(jù)PCR檢測(cè)結(jié)果可知,在轉(zhuǎn)基因三倍體毛白楊42個(gè)系號(hào)中,有33個(gè)系號(hào)檢測(cè)到Bt-API基因,陽(yáng)性率達(dá)到80％.Southern雜交分析得出,Bt基因已成功整合到轉(zhuǎn)基因三倍體毛白楊中,且各系號(hào)轉(zhuǎn)入的外源基因均為一個(gè)拷貝.2經(jīng)過(guò)抗蟲性初步篩選,其中有11個(gè)高抗系號(hào),占所有參試系號(hào)的39.3%;7個(gè)中抗系號(hào),占所有參試系號(hào)的25.0%;10個(gè)低抗系號(hào),占所有參試系號(hào)35.7%.各無(wú)性系對(duì)所測(cè)試?yán)ハx均有抗性

3、,經(jīng)楊扇舟蛾和舞毒蛾劃分的高抗、中抗系號(hào)高度一致.各無(wú)性系抗蟲性主要表現(xiàn)為對(duì)低齡幼蟲的毒殺作用,對(duì)存活的高齡幼蟲的生長(zhǎng)發(fā)育有明顯抑制作用,從而導(dǎo)致幼蟲生長(zhǎng)發(fā)育不良,甚至死亡.對(duì)幼蟲體重、體長(zhǎng)、糞重和取食量進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)高抗和中抗系號(hào)的飼養(yǎng)的幼蟲體重、體長(zhǎng)、糞重和取食量明顯小于未轉(zhuǎn)基因?qū)φ?低抗系號(hào)與未轉(zhuǎn)基因?qū)φ障嘟蚋哂趯?duì)照.通過(guò)對(duì)無(wú)性系5號(hào)、6號(hào)、47號(hào)飼養(yǎng)的幼蟲體重和糞重的分析,證明三個(gè)系號(hào)具有較強(qiáng)的殺蟲作用,且隨天數(shù)的增加,幼蟲

4、的生長(zhǎng)發(fā)育受到了一定程度的抑制.各無(wú)性系抗蟲性具有明顯的穩(wěn)定性,2002年和2003年的抗蟲規(guī)律基本一致.表明Bt-API雙抗蟲基因在轉(zhuǎn)基因植株中較穩(wěn)定,兩種參試?yán)ハx并未對(duì)轉(zhuǎn)基因植株產(chǎn)生抗性.通過(guò)對(duì)ELISA檢測(cè)的結(jié)果與抗蟲性結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性比較發(fā)現(xiàn),高抗的系號(hào)毒蛋白表達(dá)量較高,中抗系號(hào)的次之,低抗系號(hào)的毒蛋白表達(dá)量幾乎沒(méi)有.3轉(zhuǎn)基因組培苗卡那霉素篩選作為外源基因檢測(cè)的一種手段是有效的,但并不能反映轉(zhuǎn)基因單株的真實(shí)抗性,因此不能作為最終的