轉(zhuǎn)基因玉米外源基因檢測方法研究.pdf

1、沈陽農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文轉(zhuǎn)基因玉米外源基因檢測方法研究姓名：肖一爭申請學位級別：碩士專業(yè)：生物化學與分子生物學指導教師：唐詠20070601沈陽農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文摘要本研究以6種轉(zhuǎn)基因玉米(MON810、Btll、Btl76、T25、GA21和NK603)為試驗材料，研究適合的基因組DNA提取方法，建立和驗證了轉(zhuǎn)基因玉米定性PCR檢測方法，并進一步對擴增的目的片段進行克隆、測序和BLAST同源性分析，制備出轉(zhuǎn)基因玉米檢測陽性樣品。還利

2、用定性PCR檢測引物建立和優(yōu)化了復合PcR檢測體系，同時參考Kuntrudi等MQDAPCR文獻中設計的探針，將復合PCR和基因芯片結合起來，建立了高效、可靠的外源基因檢測方法。得到的結論如下：1、研究表明改良CTAB法提取的基因組DNA純度高、質(zhì)量好。用玉米內(nèi)參照基因引物擴增改良CTAB法提取的基因組DNA，結果均為陽性，這能消除下游檢測出現(xiàn)假陰性結果。2、本研究對Kuntrudi等MQDAPCR文獻中設計的引物進行驗證，驗證結果表明

3、35S枷t、NoS—F瓜、BtllF／R、Btl76F／R、T25一F／R和MoN8lOF儂引物檢測結果穩(wěn)定，可以用于轉(zhuǎn)基因玉米的定性檢測，而GA21F瓜引物檢測結果不穩(wěn)定，本研究對其進行了改進，重新建立了穩(wěn)定的定性PCR檢測體系。3、本研究還通過查詢和收集轉(zhuǎn)基因玉米NK603外源基因的構建信息，設計了NK603F／R結構特異性引物，建立和優(yōu)化了轉(zhuǎn)基因玉米NK603定性PCR檢測方法。4、對8對定性PCR檢測引物擴增得到的目的基因進行回

4、收、克隆、測序與基因數(shù)據(jù)庫比對，發(fā)現(xiàn)這些基因的特異片段就是檢測的目標，因此可以將插入這些基因片段的質(zhì)粒作為檢測工作中的陽性對照。5、本研究利用定性PCR檢測的引物，設計和優(yōu)化了復合PCR反應體系，能同時在一個PCR反應中最多擴增出6種轉(zhuǎn)基因玉米的特異性片段。6、利用Kuntrudi等MQDAPCR文獻中設計的探針，將復合PCR和基因芯片結合起來，同時檢測6種轉(zhuǎn)基因玉米的8個外源基因元件，包括CaMV35S基因、NOS基因、MaizeDN