偽狂犬病TKˉ-gEˉ基因缺失疫苗研究.pdf

1、1.偽狂犬病病毒鄂A株TKˉ/gEˉ/gⅠˉ基因缺失疫苗的研制：該研究首先用gE轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSPFZ與PrV EaTKˉ基因組DNA共轉(zhuǎn)染豬腎傳代細(xì)胞IBRS-2,在X-gal存在下進(jìn)行藍(lán)斑篩選,挑取藍(lán)班進(jìn)行空班純化,空班純化三次后獲得重組病毒PrV Ea TKˉ/gEˉ/LacZ<'+>突變株.對(duì)含有完整gE、gⅠ基因的質(zhì)粒pSKFB用StrⅠ和BamHⅠ進(jìn)行酶切,回收5753bp的片段連接,得到gE/gⅠ缺失轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFBBS.序列分

2、析表明,該質(zhì)粒缺失了從gⅠ基因StuI位點(diǎn)到gE基因BstEⅡ位點(diǎn)共計(jì)1247bp的片斷.將質(zhì)粒pFBBS與EcoRⅠ線(xiàn)性化的PrV EaTKˉ/gEˉ/LacZ<'+>突變株基因組DNA共轉(zhuǎn)染IBRS-2細(xì)胞.經(jīng)過(guò)空斑篩選獲得PrV EaTKˉ/gEˉ/gⅠˉ突變株.Southern雜交結(jié)果顯示,PrV Ea BamHI-7片斷約6.6kb,而PrV EaTkˉ/gEˉ/gⅠˉBamHI-7片斷約5.5kb,證實(shí)gE/gⅠ基因已經(jīng)缺失

3、.將接毒細(xì)胞凍融液進(jìn)行蛋白質(zhì)斑點(diǎn)雜交試驗(yàn),以鼠抗gE單克隆抗體為一抗,以羊抗鼠ⅠgG為二抗,結(jié)果PrV EaTKˉ/gEˉ/gⅠˉ及細(xì)胞對(duì)照均為陰性,而PrV Ea為陽(yáng)性,證實(shí)gE/gⅠ缺失后,突變株不能產(chǎn)生相應(yīng)的糖蛋白.在獲得PrV Ea TKˉ/gEˉ/gⅠˉ突變株后,我們對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行了系統(tǒng)的研究.2.PrV Bartha株TKˉ/LacZ<'+>突變株的構(gòu)建：用TK基因轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pUEKPZ與PrV Bartha基因組DNA共

4、轉(zhuǎn)染,經(jīng)過(guò)藍(lán)斑篩選和空斑純化獲得重組病毒PrV Bartha TKˉ/LacZ<'+>突變株.TK基因缺失后,PrV Bartha TKˉ/LacZ<'+>突變株免疫的Balb/C小鼠能夠存活,而同樣劑量的PrV Bartha卻引起部分小鼠死亡.表明該突變株生物安全性大大提高.3.偽狂犬病病毒-豬2型圓環(huán)病毒ORF2基因轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建：偽狂犬病病毒具有較大的基因組,有很多非必需基因和不編碼區(qū),這在這些區(qū)域插入外源基因構(gòu)建二價(jià)基因工程疫苗

5、是可行的.該研究以豬2型圓環(huán)病毒的基因組克隆pTPCV2為材料,用HindⅢ和EcoRV進(jìn)行酶切,回收1023bp含ORF2基因的片斷.將PCV2的ORF2基因插入gE基因缺失轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSKIECMV中,得到重組子pICORF2.以PK-15細(xì)胞、pTPCV2、pIEORF2為模板,擴(kuò)增ORF2基因494bp的片斷,結(jié)果從pTPCV2、pIEORF2中能擴(kuò)出ORF2基因,而PK-15細(xì)胞從不能擴(kuò)出.這為構(gòu)建偽狂犬病-豬2型圓環(huán)病毒二價(jià)重