我國豬偽狂犬病病毒變異株全基因組序列分析及其gE-gI基因缺失滅活疫苗免疫特性.pdf

1、本研究在病原學(xué)調(diào)查基礎(chǔ)上，從我國發(fā)病豬場分離獲得5株P(guān)RV，并以PRVZ J01毒株為研究對象，系統(tǒng)地研究其毒力、抗原特性和基因組特征，并成功構(gòu)建了ZJ01株的感染性細(xì)菌人工染色體克隆，獲得ZJ01 gE/gI基因缺失病毒，觀察其滅活疫苗免疫特性，為進(jìn)一步開展PRV變異毒株進(jìn)化機(jī)制和新型疫苗研究奠定基礎(chǔ)。
　　本研究內(nèi)容分為以下5個部分:
　　1、中國東南部豬偽狂犬病病毒超強(qiáng)毒株分離與鑒定
　　偽狂犬病病毒是威脅養(yǎng)豬業(yè)

2、的重要病原之一。自2011年底起，我國許多該病毒免疫豬場相繼出現(xiàn)仔豬嘔吐和神經(jīng)癥狀、生長豬出現(xiàn)呼吸道癥狀，死亡率明顯增高，妊娠母豬出現(xiàn)流產(chǎn)、死胎、弱仔等，造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。本研究從我國東南部4省份13個發(fā)病豬群采集38份疑似患病仔豬組織病料，29份組織病料經(jīng)PCR檢測為PRV野毒陽性。選取5份陽性組織病料進(jìn)行病毒分離及基因擴(kuò)增，病料經(jīng)無菌處理后接種BHK-21細(xì)胞，培養(yǎng)24h出現(xiàn)明顯細(xì)胞病變，病毒空斑純化3次后經(jīng)PCR與電鏡觀察鑒定為P

3、RV，分別命名為PRV ZJ01、ZJ02、GD01、GX01和JX01毒株。病毒gE和gC基因序列進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示，這些新分離株均位于相對獨立的分支，與亞洲分離株親緣關(guān)系較近。gE和gC基因序列推導(dǎo)的氨基酸序列分析結(jié)果顯示，新流行毒株與先前分離毒株相比分別有2個與7個氨基酸的插入。將PRV ZJ01分離株接種BALB/c小鼠，接種3d后出現(xiàn)奇癢并死亡。家兔接種該毒株病毒液后32h后，表現(xiàn)精神亢奮，咬接種部位直至潰爛，并相繼死亡。取2

4、4和80-85日齡PRV陰性健康豬滴鼻接種PRV ZJ01分離株，均出現(xiàn)發(fā)熱，精神沉郁，嘔吐，咳嗽，呼吸困難和神經(jīng)癥狀等癥狀及肝臟灰色壞死等病理變化，攻毒后7d內(nèi)全部死亡。選擇15頭80～85日齡健康豬，隨機(jī)分為3組，第1、2組分別滴鼻接種分別滴鼻接種107.0 TCID50 PRV ZJ01株和傳統(tǒng)毒株LA病毒液，第3組按同樣方式接種細(xì)胞培養(yǎng)物作為空白對照，結(jié)果為:試驗豬感染Z J01后臨床癥狀明顯，攻毒后7d內(nèi)全部死亡，組織病理變化

5、明顯，而LA接種組僅表現(xiàn)體溫變化與輕微呼吸道癥狀，組織病理變化輕微，表明新分離毒株ZJ01毒力明顯增強(qiáng)。
　　2、豬偽狂犬病病毒超強(qiáng)毒株ZJ01抗原特性研究
　　為了進(jìn)一步明確豬偽狂犬病超強(qiáng)毒株的抗原特性，本研究采用Z J01毒株及其血清抗體，分別與PRV Bartha-K61、Bucharest和HB-98疫苗毒株及其抗血清進(jìn)行交叉中和試驗，結(jié)果顯示，其變異系數(shù)R值為0.378～0.455，證明該分離毒株抗原發(fā)生明顯變異。

6、采用ZJ01油佐劑滅活疫苗與Bartha-K61弱毒疫苗進(jìn)行豬體免疫保護(hù)試驗，結(jié)果為:滅活疫苗免疫后產(chǎn)生的LA株特異性中和抗體水平與活疫苗組相似，但ZJ01特異性中和抗體水平顯著高于活疫苗組。PRV ZJ01攻毒后滅活疫苗組僅出現(xiàn)短時間發(fā)熱及輕微的呼吸道癥狀，相對日增重明顯高于攻毒對照組，腦組織與肺組織中抗原載量均明顯低于攻毒對照組。Bartha-K61活疫苗組攻毒后出現(xiàn)明顯呼吸道癥狀與神經(jīng)癥狀，弱毒疫苗免疫組相對日增重明顯低于滅活疫苗

7、組，腦組織與肺組織中抗原載量明顯高于滅活疫苗組，表明Bartha-K61疫苗不能對ZJ01提供完全保護(hù)。綜合上述結(jié)果，PRV ZJ01毒株抗原性出現(xiàn)明顯變異。
　　3、豬偽狂犬病病毒超強(qiáng)毒株ZJ01全基因組序列測定與分析
　　本研究采用PRV ZJ01毒株病毒液，通過病毒純化和濃縮，提取純化病毒基因組DNA，應(yīng)用Ion Torrent高通量測序方法和20個gap基因片段的PCR基因測序補(bǔ)充，獲得PRV ZJ01基因組序列，并

8、對全長基因組序列編碼基因定位及ORFs分析，結(jié)果顯示:該病毒基因全長共141029bp，GC含量達(dá)73.5％, BamHⅠ酶切位點分析結(jié)果與純化DNA BamHⅠ脈沖場凝膠電泳帶型完全吻合。PRV ZJ01編碼69種蛋白;相對Bartha-K61疫苗毒株、Kaplan與Becker強(qiáng)毒株，ZJ01株重要的編碼蛋白AA具有突變、插入與缺失現(xiàn)象，例如:gE蛋白AA序列的46位插入D，第418位有V＞A突變;gI糖蛋白AA序列在第29(V＞A

9、)、238-246與340(N＞T)有變異;與中國傳統(tǒng)毒株Ea或HNYD-2008-China相比，ZJ01株gB糖蛋白第75-77插入三個AA(+SPG)，59-126AA與540-734AA也有多處變異位點;與歐美分離株Becker和Kaplan及中國傳統(tǒng)毒株Ea與SA215相比，ZJ01毒株gC糖蛋白第63-67位插入7個AA(+AAASTPA)。UL2蛋白有7個AA連續(xù)插入，UL12基因也有1個AA插入，UL50第22位有AA有

10、插入，同時伴有許多特異性點突變;IE180即刻早期基因蛋白也有多處插入、缺失及點突變。此外，Z J01—毒株UL30、UL34、UL39、UL14、EP0、IE180、UL1、US2與US6基因的調(diào)控序列也有較多突變?；蜻M(jìn)化樹分析結(jié)果表明，ZJ01分離株處于相對獨立的分支。PRV ZJ01全基因組序列的解析有助于進(jìn)一步研究其毒力及抗原變異機(jī)制。
　　4、豬偽狂犬病病毒超強(qiáng)毒株ZJ01感染性細(xì)菌人工染色體克隆的構(gòu)建與鑒定
　

11、　自2011年底起，我國許多偽狂犬病免疫豬群相繼出現(xiàn)仔豬嘔吐和神經(jīng)癥狀、生長豬出現(xiàn)呼吸道癥狀，死亡率明顯增高，妊娠母豬出現(xiàn)流產(chǎn)、死胎、弱仔等，造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失，對偽狂犬病病毒一流行毒株P(guān)RVZJ01的致病性和抗原性研究已經(jīng)證明:該流行毒株為強(qiáng)毒力偽狂犬病病毒抗原變異株。本研究設(shè)計2對引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增位于PRV Z J01毒株US7和US8（gE/gI）基因序列兩端同源重組臂，與攜帶細(xì)菌人工染色體(Bacterial Artificia

12、l Chromosome，BAC)載體和gfp表達(dá)盒的pHA2質(zhì)粒分別連接，構(gòu)建轉(zhuǎn)移栽體pHA2-pUC19-H1-H2。將該轉(zhuǎn)移載體與ZJ01毒株全基因組共轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，通過同源重組，將含mini-F和gfp表達(dá)盒的基因插入到PRV ZJ01病毒的US7與US8（gI與gE）基因內(nèi)，獲得重組病毒vZJ01-GFP△gE/gI。提取該重組病毒的環(huán)狀基因組DNA，電轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌宿主菌DH10B，篩選獲得含有mini-F序列

13、的PRV感染性BAC克隆(pZJ01)。將pZJ01轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞可以重新啟動病毒的生產(chǎn)性感染，該質(zhì)粒與pUC19-H1-H2或gE/gI基因片段全長共轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，通過同源重組進(jìn)一步刪除mini-F序列，構(gòu)建獲得gE/gI基因雙缺失病毒vZJ01△gE/gI或無痕恢復(fù)病毒vZJ01 gE/gI-R。拯救獲得的3個病毒vZJ01-GFP△gE/gI、vZJ01△gE/gI與vZJ01 gE/gI-R產(chǎn)生的細(xì)胞病變和體外增殖

14、特性與親本病毒ZJ01一致，表明gE/gI基因的刪除或BAC載體的插入不會影響PRV體外復(fù)制。將ZJ01和vZJ01△gE/gI接種小鼠和家兔，vZJ01△gE/gI攻毒組小鼠與家兔比ZJ01攻毒組存活時間明顯延長。55～60日齡健康豬滴鼻接種等量PRV Z J01和vZJ01△gE/gI，結(jié)果顯示，ZJ01攻毒組豬臨床癥狀明顯，攻毒后7d內(nèi)全部死亡，具有PRV典型組織病理變化，vZJ01△gE/gI攻毒組后僅表現(xiàn)輕度體溫反應(yīng)，14d觀

15、察期內(nèi)未出現(xiàn)死亡，組織學(xué)病理變化輕微。
　　5、豬偽狂犬病病毒超強(qiáng)毒ZJ01 gE/gI基因缺失株滅活疫苗免疫保護(hù)作用
　　本研究將豬偽狂犬病病毒超強(qiáng)毒株ZJ01 gE/gI基因缺失病毒vZJ01△gE/gI經(jīng)甲醛滅活處理，制成油乳劑滅活疫苗，以Bartha-K61活疫苗作為對照組進(jìn)行仔豬免疫保護(hù)試驗，評價vZJ01△gE/gI滅活疫苗的免疫保護(hù)效果。結(jié)果為:vZJ01△gE/gI滅活疫苗免疫組豬PRV gB抗體均為陽性，g

16、E抗體均為陰性。兩個免疫組產(chǎn)生的Bartha-K61特異性中和抗體水平相似(P＞0.05)，vZJ01△gE/gI免疫組產(chǎn)生的ZJ01特異性中和抗體水平顯著高于Bartha-K61活疫苗組(P＜0.05)。試驗豬滴鼻攻擊PRV ZJ01后，非免疫攻毒對照組出現(xiàn)嚴(yán)重臨床癥狀，表現(xiàn)明顯呼吸道癥狀與神經(jīng)癥狀，并在攻毒后7d內(nèi)全部死亡。vZJ01△gE/gI滅活疫苗組攻毒后無明顯臨床癥狀，腦和肺組織PRV載量明顯低于攻毒對照組(P＜0.05)，

17、而Bartha-K61免疫組2/5豬出現(xiàn)明顯臨床癥狀，相對日增重明顯低于空白對照組(P＜0.05)，腦和肺組織PRV載量明顯高于vZJ01△gE/gI滅活疫苗組和空白對照組（P＜0.05），表明vZJ01△gE/gI滅活疫苗能抵御致死量PRVZJ01攻擊。上述結(jié)果表明，PRV ZJ01 gE/gI基因缺失株vZJ01△gE/gI滅活疫苗可以提供對PRV超強(qiáng)毒的免疫保護(hù)作用，其免疫效果優(yōu)于Bartha-K61活疫苗，而且免疫抗體可以與PR

18、V野毒抗體相區(qū)分，為我國防控變異PRV奠定了重要基礎(chǔ)。
　　綜上所述，自2011年下半年開始，我國東南部地區(qū)出現(xiàn)豬偽狂犬病病毒流行。PRV ZJ01毒株毒力明顯增強(qiáng)，抗原性發(fā)生變化，故將其定名為偽狂犬病病毒超強(qiáng)毒株。根據(jù)ZJ01全基因組測序和基因進(jìn)化樹分析，ZJ01屬于一個獨立基因分支。同時，成功構(gòu)建PRV ZJ01感染性BAC克隆，獲得ZJ01 gE/gI基因缺失毒株vZJ01△gE/gI，證明其滅活疫苗能有效抵御致死量Z J0