嵌套式PCR超靈敏檢測馬鈴薯環(huán)腐病菌.pdf

1、該研究先是應用國外成功報道的根據(jù)存在于pCSI質粒和環(huán)腐菌染色體中一個1.3kb的插入因子IS1121、高度重復的DNA片段設計的環(huán)腐病菌亞種特異引物序列合成出引物對CMSIF-1-CMSIR1和引物對CMSIF2-CMSIR2.由于引物對CMSIF1-CMSIR1和引物對CMSIF2-CMSIR2序列中的G、C的含量較高,在反應體系中適當加入甲酰胺,比較實驗結果甲酰胺可大大降低錯配率,提高了特異性片段的產(chǎn)量.分別以環(huán)腐菌基因組DNA和

2、菌懸液為模板進行直接PCR,結果表明以菌懸液為模板仍可同樣得到特異性片段(直接PCR以引物對CMSIF1-CMSIR1擴增出1046bp的片段,這個結果大大簡化了提取細菌基因組DNA的步驟.分別以環(huán)腐菌菌懸液和直接PCR產(chǎn)物為模板應用嵌套式PCR中的引物對CMSIF2-CMSIR2進行擴增,結果表明只有經(jīng)過直接PCR擴增嵌套式PCR擴增才有特異性產(chǎn)物產(chǎn)生.以環(huán)腐標準菌株、黑龍江省環(huán)腐菌株以及馬鈴薯上其它主要的細菌病原菌(青枯病、軟腐病、

3、黑脛病)為實驗材料進行直接PCR和嵌套式PCR擴增,結果只有環(huán)腐標準菌株和黑龍江省環(huán)腐菌株出現(xiàn)特異性片段(直接PCR擴增出1046bp的片段,嵌套式PCR擴增出864bp的片段).將環(huán)腐菌純菌種菌懸液稀釋成濃度梯度并與馬鈴薯組織液混合進行直接PCR和嵌套式PCR檢測靈敏度比較,結果表明嵌套式PCR檢測靈敏度比直接PCR檢測靈敏度提高了100-1000倍,同時與間接ELISA方法檢測靈敏度進行了比較.以明顯病癥狀的塊莖、無明顯感病癥狀的塊