水稻五個(gè)防衛(wèi)相關(guān)基因的cDNA克隆及功能分析.pdf

1、中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文水稻五個(gè)防衛(wèi)相關(guān)基因的cDNA克隆及功能分析姓名：秦慶明申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：植物病理學(xué)指導(dǎo)教師：彭友良2002.6.1雜交表明水稻基因組中含有O s P M - 1 和O s P M - I I 各1 個(gè)拷貝。O s P M - I 和O s P M - I I 基因轉(zhuǎn)錄激活與稻瘟菌侵染有關(guān)，O s P M - I 還與水稻抵御不同形式的傷害有關(guān)，它們的功能及在抗病性中的作用仍有待進(jìn)一步研究。此外，作者還從蛋

2、白質(zhì)純化一基因克隆_ 轉(zhuǎn)基因的途徑，重點(diǎn)研究了稻瘟菌侵染誘導(dǎo)的水稻過(guò)氧羥基脂肪酸羥化環(huán)氧化酶( p c r o x y g e n a s e 。P O G ) 的基因克隆與功能。在進(jìn)行此部分研究中，作者首先根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室純化的水稻P O G 的一段氨基酸序列，合成了兩對(duì)互補(bǔ)的混合寡核苷酸引物。并通過(guò)P C R 擴(kuò)增從稻瘟菌侵染水稻稻葉e D N A 文庫(kù)中獲得了一段長(zhǎng)約7 0 0 b p 的產(chǎn)物，序列測(cè)定和分析證明該e D N A 片段

3、推斷的氨基酸與用于引物設(shè)計(jì)的水稻P O G 的氨基酸完全一致；進(jìn)一步以此e D N A 片段為探針，從上述e D N A 文庫(kù)中獲得了P O G 的全長(zhǎng)e D N A 克隆，暫定名為O s P O G 。O s P O G 的全長(zhǎng)e D N A 為1 7 9 0 b p ，其中開(kāi)放閱讀框?yàn)? 4 3 4 b p ，其編碼的產(chǎn)物為含有4 7 8個(gè)氨基酸殘基的蛋白，推定的分子量為5 2K D a 。序列分析表明：O s P O G 推導(dǎo)的氨

4、基酸序列與不同植物來(lái)源的A O S 、氫過(guò)氧化物裂解酶( h y d r o p e r o x i d el y a s e ．簡(jiǎn)稱H P L ) 、二乙烯乙醚合成酶( d i v i n y le t h e rs y n t h a s e ，簡(jiǎn)稱D E S ) 一致性在4 5 ％以上。在推斷的O s P O G氨基酸序列中，有細(xì)胞色素P 4 5 0C Y P 7 4 一致的血紅素結(jié)合區(qū)P x V x N K Q A G ( 細(xì)胞

5、色素P 4 5 0 保守的血紅素結(jié)合區(qū)F x x G x x x C x G 的變體) ，因此，O s P O G 也屬于細(xì)胞色素P 4 5 0C Y P 7 4 中的一成員G e n o m i cS o u t h e r n 雜交結(jié)果表明：O s P O G 以單拷貝存在水稻基因組中。但較低嚴(yán)緊度的條件下進(jìn)行分子雜交顯示水稻基因組中至少還存在1 個(gè)與O s P O G 同源的類似物。N o r t h e r n 雜交結(jié)果顯示：稻

6、瘟菌侵染、外源施用S A 或J A 以及紫外線輻射可誘導(dǎo)O s P O G轉(zhuǎn)錄物累積；但在A B A 處理和機(jī)械傷害的葉片中，未檢測(cè)到O s P O G 轉(zhuǎn)錄物的明顯積累。因此，P O G 的表達(dá)可能是水稻的～個(gè)重要防衛(wèi)反應(yīng)．在正常情況下．O s P O G 基因轉(zhuǎn)錄物僅在根中有少量積累，表明O s P O G 表達(dá)與水稻地上部分的正常發(fā)育沒(méi)有關(guān)系。為了進(jìn)一步分析P O G 的生化特征，作者構(gòu)建并確認(rèn)了O s P O G 的原核表達(dá)載體

7、，通過(guò)S D S ．P A G E 和w e s t e r n - b l o t t i n g 確認(rèn)了重組P O G 在大腸桿菌中的表達(dá)。酶活性測(cè)定結(jié)果表明重組O s P O G 表達(dá)產(chǎn)物具有P O G 活性。為了確定O s P O G 誘導(dǎo)表達(dá)在水稻抗瘟性中的作用與作用機(jī)理，作者分別構(gòu)建了O s P O G 的s e n s e ，a n t i s e n s e 和s e n s e ／a n t i s e n s e (