皮秒脈沖電場(chǎng)抗宮頸癌移植瘤血管生成效應(yīng)及機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、近年來(lái)，世界范圍內(nèi)都致力于發(fā)現(xiàn)新的惡性腫瘤治療策略，作為一種新興的腫瘤生物學(xué)治療方法，脈沖電場(chǎng)(pulsed electric fields, PEF)逐漸被人們所重視。根據(jù)脈寬的不同，脈沖電場(chǎng)又分為毫秒脈沖電場(chǎng)、微秒脈沖電場(chǎng)、納秒脈沖電場(chǎng)以及皮秒脈沖電場(chǎng)。目前對(duì)毫秒、微秒和納秒級(jí)脈沖電場(chǎng)的研究已取得了較大進(jìn)展：基于微秒級(jí)脈沖電場(chǎng)可逆性電穿孔現(xiàn)象的電化學(xué)療法是繼手術(shù)、放療和化療之后治療惡性腫瘤的一種新的有效方法；納秒級(jí)脈沖電場(chǎng)引起的一系

2、列稱為細(xì)胞內(nèi)處理效應(yīng)的細(xì)胞反應(yīng)，在腫瘤的治療中也展現(xiàn)出了較好的前景。然而，微秒及納秒脈沖電場(chǎng)需要采用電極陣列穿刺至腫瘤組織才能將電場(chǎng)傳輸至腫瘤內(nèi)部，因此在一定程度上限制了它們的臨床應(yīng)用。
　　皮秒脈沖電場(chǎng)通過沖激脈沖輻射天線無(wú)創(chuàng)地將脈沖電場(chǎng)傳輸至生物組織內(nèi)部，能有效的殺傷腫瘤細(xì)胞，并且能避免對(duì)腫瘤組織周邊正常組織的損傷，從而實(shí)現(xiàn)腫瘤的無(wú)創(chuàng)治療。因此，皮秒脈沖電場(chǎng)匹配超寬帶的沖激脈沖輻射天線以其優(yōu)異的特性在生物醫(yī)學(xué)治療領(lǐng)域引起了人們

3、極大的興趣。
　　由于新生血管在腫瘤的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移方面發(fā)揮著重要作用，因此抑制腫瘤血管生成，阻斷腫瘤營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，是抗腫瘤血管生成治療的主要理論基礎(chǔ)。然而，目前研究者們?cè)谶@方面的研究主要集中在微秒和納秒脈沖電場(chǎng)，其中Cemazar等發(fā)現(xiàn)微秒脈沖電場(chǎng)可以直接損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致血流中斷，增強(qiáng)對(duì)腫瘤的毒性作用；Chen等用納秒脈沖作用于小鼠肝細(xì)胞癌，發(fā)現(xiàn)VEGF表達(dá)降低，MVD降低。據(jù)查新，還沒有皮秒脈沖電場(chǎng)對(duì)腫瘤血管生成影響的實(shí)驗(yàn)

4、研究。
　　在惡性腫瘤中，因?qū)m頸癌從早期的癌前病變發(fā)展到真正的惡性病變存在一個(gè)較長(zhǎng)的“窗口期”（數(shù)年至十余年不等），因此被稱為“善良的惡性腫瘤”。這一較長(zhǎng)的“窗口期”為皮秒脈沖電場(chǎng)治療提供了一個(gè)非常合適的時(shí)機(jī)。因此本課題以BALB/c裸鼠為人宮頸癌移植瘤動(dòng)物模型的載體，從組織水平深入研究皮秒脈沖電場(chǎng)抗宮頸癌移植瘤血管生成效應(yīng)及機(jī)制，從而完善皮秒脈沖電場(chǎng)用于腫瘤治療的相關(guān)研究。
　　第一部分皮秒脈沖電場(chǎng)對(duì)宮頸癌移植瘤的殺傷效應(yīng)

5、及抗血管生成效應(yīng)
　　第一節(jié)宮頸癌動(dòng)物模型的構(gòu)建
　　目的：構(gòu)建宮頸癌移植瘤動(dòng)物模型。
　　方法：將制備好的人宮頸癌HeLa細(xì)胞懸液0.2ml（5×106/ml）接種于裸鼠右下肢大腿根部皮下。當(dāng)腫瘤直徑長(zhǎng)至0.8-1.0cm的時(shí)候，取下腫瘤并將其切成1.5×1.5cm3的小塊，迅速接種于待接種裸鼠皮下，以構(gòu)建人宮頸癌移植瘤模型。約三周左右移植瘤直徑可達(dá)1.0cm。
　　結(jié)果：成功構(gòu)建人宮頸癌移植瘤動(dòng)物模型。

6、>　　第二節(jié)皮秒脈沖電場(chǎng)對(duì)宮頸癌移植瘤的殺傷效應(yīng)
　　目的：離體觀察皮秒脈沖電場(chǎng)對(duì)宮頸癌移植瘤的作用
　　方法：將人宮頸癌移植瘤裸鼠隨機(jī)分為四個(gè)組：對(duì)照組（無(wú)任何處理）、50kV/cm處理組、60kV/cm處理組和70kV/cm處理組。其中，三個(gè)實(shí)驗(yàn)組其它參數(shù)固定如下：脈寬800ps，頻率3Hz，脈沖個(gè)數(shù)2000個(gè)。皮秒脈沖電場(chǎng)處理后一周取下腫瘤進(jìn)行組織切片。分別采用HE染色和透射電子顯微鏡觀察腫瘤組織的大體變化及腫瘤細(xì)胞、

7、血管內(nèi)皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化。
　　結(jié)果：皮秒脈沖電場(chǎng)處理后一周，實(shí)驗(yàn)組腫瘤組織壞死面積隨著皮秒脈沖電場(chǎng)強(qiáng)度的增加而增大，壞死程度也逐漸加重；電鏡下，實(shí)驗(yàn)組腫瘤細(xì)胞內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體隨電場(chǎng)強(qiáng)度的增加呈現(xiàn)不同程度的腫脹和擴(kuò)張，同時(shí)細(xì)胞間連接逐漸減少，70kV/cm處理組，腫瘤細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞幾乎無(wú)法辨別。
　　結(jié)論：皮秒脈沖電場(chǎng)對(duì)宮頸癌移植瘤腫瘤細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞具有明顯的殺傷效應(yīng)。
　　第三節(jié)皮秒脈沖電場(chǎng)對(duì)宮頸癌移植瘤血

8、管生成的影響
　　目的：在體和離體觀察皮秒脈沖電場(chǎng)對(duì)宮頸癌移植瘤血管生成的影響。
　　方法：實(shí)驗(yàn)分組及皮秒脈沖電場(chǎng)處理方法同前。于皮秒脈沖電場(chǎng)處理前和處理后一周，通過裸鼠尾靜脈注射光聲造影劑ICG，采用光聲成像技術(shù)在體觀察移植瘤組織內(nèi)的血管變化情況；光聲成像后取下移植瘤進(jìn)行組織切片，免疫組化染色體外觀察腫瘤組織內(nèi)血管的變化情況。
　　結(jié)果：與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組腫瘤組織內(nèi)血管的光聲信號(hào)隨著電場(chǎng)強(qiáng)度的增加而逐漸減弱，其中以

9、60kV/cm和70kV/cm處理組下降最為明顯；免疫組化結(jié)果表明：實(shí)驗(yàn)組腫瘤組織內(nèi)微血管密度隨著電場(chǎng)強(qiáng)度的增強(qiáng)逐漸下降，同樣以60kV/cm和70kV/cm處理組下降最為明顯。
　　結(jié)論：皮秒脈沖電場(chǎng)具有抗宮頸癌移植瘤血管生成的效應(yīng)。
　　第二部分皮秒脈沖電場(chǎng)抗宮頸癌移植瘤血管生成效應(yīng)的機(jī)制
　　目的：研究皮秒脈沖電場(chǎng)抗宮頸癌移植瘤血管生成效應(yīng)的機(jī)制。
　　方法：實(shí)驗(yàn)分組及皮秒脈沖處理方法同前。于皮秒脈沖電場(chǎng)處

10、理前和處理后一周，采用光聲成像技術(shù)在體觀察移植瘤內(nèi)血氧飽和度的變化情況。光聲成像后取下腫瘤組織進(jìn)行組織切片，免疫組化染色觀察腫瘤內(nèi)血管生成相關(guān)因子HIF1α和VEGF的組織表達(dá)情況；WB和PCR從翻譯和轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)上述因子的蛋白和基因表達(dá)情況。
　　結(jié)果：與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組移植瘤內(nèi)血氧飽和度隨著皮秒脈沖電場(chǎng)強(qiáng)度的增加逐漸下降，以60kV/cm和70kV/cm處理組下降最為明顯。同時(shí)，免疫組化結(jié)果顯示，隨著皮秒脈沖電場(chǎng)強(qiáng)度的增大，