納米雄黃混懸液抗宮頸癌的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本文主要從以下三個(gè)部分展開(kāi)論述：
　　第一部分 納米雄黃混懸液的制備
　　目的:雄黃是我國(guó)的傳統(tǒng)中藥,它的主要成分為硫化砷(As4S4或As2S2),另外還含有少量三氧化二砷(As2O3)及五氧化二砷(As2O5)。由于雄黃在臨床上的特殊功效及其毒性反應(yīng),自古就很重視它的炮制處理。但雄黃難溶于水,胃腸道吸收差,生物利用度低,故臨床用藥劑量大,阻礙了雄黃的臨床應(yīng)用推廣。目前,納米技術(shù)的發(fā)展,為我們優(yōu)化雄黃制劑提供了新的思路。我

2、們?cè)谇叭搜芯康幕A(chǔ)上制備納米雄黃混懸液,為雄黃體外抗腫瘤研究提供實(shí)驗(yàn)理論基礎(chǔ)。
　　方法:經(jīng)去毒處理后按藥典規(guī)定方法測(cè)得 As4S4含量為92.3％的雄黃原料粉,經(jīng)球磨機(jī)粉碎,將過(guò)500目篩的雄黃樣品3 g,加蒸餾水至300 mL,磁力攪拌器攪拌30 min,加入M-110EH型微射流制粒機(jī)30000rpm·min-1,10個(gè)循環(huán),最后1次5000rpm·min-1。超聲震蕩30 min,再過(guò)0.22μm微孔濾器除菌,密封避光4℃

3、保存。在Nicomp380 ZLS型粒度測(cè)定儀上測(cè)定粒度;采用砷鉬藍(lán)法測(cè)定樣品中的砷含量;繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,測(cè)定樣品中As2O3含量的變化;通過(guò)掃描電鏡觀察納米雄黃混懸液的微觀形貌。
　　結(jié)果:應(yīng)用微射流法制備了平均粒徑為186.8 nm左右的納米雄黃混懸液,其砷含量為9.27 mg·g-1, As2O3含量為1.86 mg·g-1。密封避光4℃保存,在60d內(nèi) As2O3含量略有增加(1.86 mg·g-1增加到2.1mg·g-1)

4、。掃描電鏡觀察所得納米雄黃顆粒顆粒均勻分散,沒(méi)有發(fā)生團(tuán)聚。說(shuō)明納米雄黃混懸液在密封避光4℃的環(huán)境中具備一定的物理穩(wěn)定性。
　　結(jié)論:制備了物理及化學(xué)特性較穩(wěn)定的納米雄黃混懸液。
　　第二部分 宮頸癌SiHa細(xì)胞體外藥敏試驗(yàn)
　　目的:探討納米雄黃混懸液體外對(duì)宮頸癌SiHa細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、乳腺癌MCF-7細(xì)胞、肝癌HepG2細(xì)胞的抑制率,了解不同實(shí)體瘤細(xì)胞株對(duì)納米雄黃混懸液的敏感性。
　　方法:將納米雄黃混懸液

5、按倍比稀釋法配制成不同實(shí)驗(yàn)濃度梯度的藥物(6.25,12.5,25,50 mg·L-1)作用于宮頸癌SiHa細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、乳腺癌MCF-7細(xì)胞、肝癌HepG2細(xì)胞不同時(shí)間段(12,24,48,72 h)后,應(yīng)用MTT比色法比較其對(duì)不同實(shí)體瘤細(xì)胞抑制率的影響,并應(yīng)用 Bliss法計(jì)算納米雄黃混懸液對(duì)不同腫瘤細(xì)胞的半數(shù)有效濃度(IC50),檢測(cè)不同實(shí)體瘤細(xì)胞株對(duì)納米雄黃混懸液的敏感性。
　　結(jié)果:MTT比色法顯示,納米雄黃混懸液

6、對(duì)宮頸癌SiHa細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、乳腺癌MCF-7細(xì)胞、肝癌HepG2細(xì)胞均有抑制作用,均呈時(shí)間-劑量依賴關(guān)系,與對(duì)照組比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);用Bliss法計(jì)算納米雄黃混懸液對(duì)四株細(xì)胞的IC50值,結(jié)果分別為18.71 mg·L-1,38.95 mg·L-1,26.14mg·L-1和64.01 mg·L-1,由此可見(jiàn),納米雄黃混懸液抑制SihHa細(xì)胞增殖的作用最強(qiáng)。
　　結(jié)論:對(duì)納米雄黃混懸液的敏感度從高到低依次

7、為宮頸癌SiHa細(xì)胞、乳腺癌MCF-7細(xì)胞、宮頸癌HeLa細(xì)胞、肝癌HepG2細(xì)胞。
　　第三部分 納米雄黃混懸液誘導(dǎo)宮頸癌SiHa細(xì)胞凋亡機(jī)制的初步探討
　　第一節(jié) 宮頸癌中RCAS1表達(dá)與HPV16E6、HPV16E7表達(dá)的關(guān)系研究
　　目的:探討宮頸癌中RCAS1蛋白表達(dá)與HPV16E6、HPV16E7蛋白表達(dá)的關(guān)系,為進(jìn)一步研究HPV感染的免疫逃逸機(jī)制提供理論依據(jù)。
　　方法:1.采用免疫組化S-P(st

8、reptavidin-peroxidase)法,分別檢測(cè)71例宮頸癌,76例子宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變(CIN)及20例正常宮頸組織中RCAS1蛋白與HPV16 E6、E7蛋白的表達(dá),并分析其相關(guān)性。
　　2.Western Blot檢測(cè)宮頸癌SiHa細(xì)胞中RCAS1蛋白與HPV16 E6、E7蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:1. RCAS1蛋白主要表達(dá)于癌細(xì)胞膜和/或細(xì)胞漿,從正常宮頸組織到CIN再到宮頸癌組織,RCAS1蛋白的陽(yáng)性表達(dá)

9、率分別為0、39.47%和77.46%,提示隨著宮頸病變惡性程度的進(jìn)展RCAS1表達(dá)逐漸增強(qiáng)(P<0.05)。低分化宮頸癌組中RCAS1陽(yáng)性表達(dá)顯著高于高、中分化宮頸癌組(P<0.01);但與患者年齡、臨床分期及組織學(xué)分型無(wú)關(guān)(P>0.05)。
　　2.HPV16 E6蛋白主要表達(dá)于癌細(xì)胞核,從正常宮頸組織到CIN再到宮頸癌組織, HPV16 E6蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率分別為10%、35.53%和60.56%,提示隨著宮頸病變惡性程度的

10、進(jìn)展HPV16 E6表達(dá)逐漸增強(qiáng)(P<0.05)。HPV16 E6陽(yáng)性表達(dá)在低分化宮頸癌組中顯著高于高、中分化宮頸癌組(P<0.01);但與患者年齡、臨床分期、組織學(xué)分型無(wú)關(guān)(P>0.05)。
　　3.HPV16 E7蛋白主要表達(dá)于癌細(xì)胞核,從正常宮頸組織到CIN再到宮頸癌組織, HPV16 E7蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率分別為5%、28.94%和61.97%,提示隨著宮頸病變惡性程度的進(jìn)展HPV16 E7表達(dá)均逐漸增強(qiáng)(P<0.05)。H

11、PV16 E7在鱗癌組中的陽(yáng)性表達(dá)顯著高于腺癌組(P<0.01);但與患者年齡、臨床分期、組織學(xué)分級(jí)無(wú)關(guān)(P>0.05)。
　　4.宮頸病變組織中RCAS1蛋白的異常表達(dá)與HPV16E7蛋白陽(yáng)性表達(dá)呈正相關(guān)(P<0.01),與HPV16E6蛋白陽(yáng)性表達(dá)呈正相關(guān)(P<0.01)。
　　5.通過(guò)Western Blot均檢測(cè)到宮頸癌SiHa細(xì)胞中HPV16E6、E7蛋白及RCAS1蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)論:RCAS1蛋白在宮

12、頸癌組織中表達(dá)增強(qiáng),RCAS1表達(dá)強(qiáng)度與宮頸癌惡性程度相關(guān);RCAS1陽(yáng)性的宮頸癌組織中存在HPV16感染。宮頸癌SiHa細(xì)胞中存在RCAS1蛋白和HPV16E6、E7蛋白的表達(dá)。
　　第二節(jié) 納米雄黃混懸液誘導(dǎo)宮頸癌SiHa凋亡及對(duì)HPV16E6、E7和RCAS1表達(dá)的影響
　　目的:初步探討納米雄黃混懸液誘導(dǎo)宮頸癌SiHa細(xì)胞凋亡的機(jī)制及HPV16E6、E7和RCAS1表達(dá)的影響。從一個(gè)新的角度對(duì) HPV病毒的生物學(xué)性狀

13、進(jìn)行研究,為宮頸癌的臨床預(yù)防、治療提供理論依據(jù)。
　　方法:將不同質(zhì)量濃度的納米雄黃混懸液(6.25,12.5,25,50 mg·L-1)作用于宮頸癌SiHa細(xì)胞不同時(shí)間段(12,24,48,72 h),通過(guò)光鏡和透射電鏡觀察實(shí)驗(yàn)組(不同質(zhì)量濃度的納米雄黃混懸液處理組)和對(duì)照組(不加藥物的細(xì)胞)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化;吖啶橙染色檢測(cè)凋亡細(xì)胞;瓊脂糖凝膠電泳觀察凋亡細(xì)胞DNA Ladder形成;流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞周期改變;用R

14、T-PCR方法檢測(cè)Bcl-2、Bax、HPV16 E6、E7和RCAS1mRNA的表達(dá);用 Western Blot方法檢測(cè)HPV16 E6、E7和RCAS1蛋白表達(dá)量的變化?？疾旒{米雄黃混懸液對(duì)宮頸癌SiHa細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)。
　　結(jié)果:1.納米雄黃混懸液25,50 mg·L-1處理SiHa細(xì)胞48 h后,細(xì)胞存活率明顯降低,凋亡增加,電鏡顯示細(xì)胞呈典型的凋亡形態(tài)學(xué)改變;細(xì)胞進(jìn)行吖啶橙染色后大多表現(xiàn)為凋亡樣變化;瓊脂糖凝膠電泳

15、顯示凋亡細(xì)胞DNA Ladder形成;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)表明納米雄黃混懸液致細(xì)胞凋亡呈濃度依賴性,與對(duì)照組相比,差異有極顯著意義(P<0.01),且細(xì)胞呈G0/G1期阻滯。
　　2. RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,納米雄黃混懸液25,50 mg·L-1處理SiHa細(xì)胞48,72 h后,宮頸癌SiHa細(xì)胞中Bcl-2、HPV16 E6、E7和RCAS1 mRNA的表達(dá)不同程度地受到抑制,而B(niǎo)ax mRNA的表達(dá)明顯升高,與正常對(duì)照組比較,均

16、有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。而納米雄黃混懸液6.25,12.5 mg·L-1組,上述表現(xiàn)與正常對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。
　　3. Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示,納米雄黃混懸液25,50 mg·L-1處理SiHa細(xì)胞48,72 h后,宮頸癌SiHa細(xì)胞中HPV16 E6、E7和RCAS1蛋白表達(dá)亦不同程度地受到抑制,與對(duì)照組比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01),而納米雄黃混懸液6.25,12.5 mg·