小鼠β-防御素2抗宮頸癌作用及其機(jī)制的研究.pdf

1、目的： 抗菌肽是天然免疫的重要介質(zhì)，具有廣泛的抗菌活性，是機(jī)體防御感染的重要因素。防御素是最早發(fā)現(xiàn)的抗菌肽之一，分為四個(gè)類型：即α-防御素、β-防御素、植物防御素和昆蟲(chóng)防御素。其中，β-防御素(BD)在組織中的表達(dá)具有特異性，在局部黏膜免疫中起重要作用。β-防御素-2(BD2)是防御素家族重要成員，在天然免疫和獲得性免疫中均發(fā)揮重要作用，被認(rèn)為是聯(lián)系先天免疫和獲得性免疫的橋梁。近年來(lái)，防御素抗腫瘤活性日益受到科研工作者的關(guān)注。很

2、多研究表明防御素在多種惡性腫瘤如多發(fā)性骨髓瘤、胃癌、鼻咽癌等的治療中發(fā)揮著重要的作用。宮頸癌是女性高發(fā)腫瘤，占女性惡性腫瘤死亡原因第二位。尤其在發(fā)展中國(guó)家以及少數(shù)發(fā)達(dá)國(guó)家，宮頸癌發(fā)病率居高不下。本研究通過(guò)研究小鼠β-防御素-2(mBD2)在體內(nèi)外的抗腫瘤作用及其機(jī)制，以期為宮頸癌的預(yù)防及生物治療提供新的思路。 方法： (1) 通過(guò)向小鼠腹腔注射LPS，誘導(dǎo)BALB/c小鼠建立急性時(shí)相反應(yīng)。提取急性時(shí)相反應(yīng)小鼠肺組織RNA

3、，采用RT-PCR擴(kuò)增mBD2基因全長(zhǎng)序列，并構(gòu)建pcDNA3.1(+)/mBD2真核表達(dá)質(zhì)粒。 (2) 將pcDNA3.1(+)/mBD2、pcDNA3.1(+)/rmBD2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染宮頸癌細(xì)胞株SiHa，同時(shí)設(shè)立轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)的空質(zhì)粒對(duì)照。采用G418對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行穩(wěn)定表達(dá)株的篩選，并對(duì)篩選得到的細(xì)胞株采用RT-PCR、Western.Blot、免疫熒光染色等方法進(jìn)行鑒定。采用細(xì)胞活力分析儀及TUNEL、Annex

4、in V等方法測(cè)定細(xì)胞活力和細(xì)胞凋亡，并計(jì)算細(xì)胞凋亡指數(shù)。 (3) 采用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株建立裸鼠移植瘤模型，觀察腫瘤生長(zhǎng)情況并測(cè)量其直徑，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線。采用HE、免疫組織化學(xué)方法觀察腫瘤組織病理改變和mBD2在腫瘤組織中的表達(dá)情況，并用TUNEL法檢測(cè)腫瘤組織的凋亡情況。 (4) 為探討mBD2對(duì)小鼠機(jī)體免疫功能的影響，建立BALB/c小鼠U14宮頸癌移植瘤模型，觀察腫瘤生長(zhǎng)情況。采用無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大抽試劑盒抽提pcDN

5、A3.1(+)/mBD2、pcDNA3.1(+)/rmBD2和 pcDNA3.1(+)質(zhì)粒DNA。將荷瘤小鼠隨機(jī)分為5組，分別采用抽提后去內(nèi)毒素pcDNA3.1(+)/mBD2、pcDNA3.1(+)/rmBD2質(zhì)粒治療，同時(shí)設(shè)立pcDNA3.1(+)、Pt和PBS組對(duì)照；觀察腫瘤生長(zhǎng)狀況、荷瘤小鼠存活時(shí)間，繪制小鼠生存曲線，采用HE、免疫組織化學(xué)方法觀察瘤組織病理改變和mBD2在腫瘤組織中的表達(dá)情況，并采用PE-JIEXAS Rad、

6、PE-Cy7標(biāo)記的抗小鼠CD4<'+>、CD8<'+>單克隆抗體檢測(cè)各組小鼠外周血CD4<'+>T、CD8<'+>T含量及比值。同時(shí)采用瑞氏染色觀察小鼠外周血血象變化。 結(jié)果： (1) 成功提取小鼠肺組織RNA，采用RT-PCR擴(kuò)增得到了大約250 bp左右的目的條帶。構(gòu)建得到的pcDNA3.1(+)/mBD2質(zhì)粒經(jīng)EcoR I和Xho I雙酶切得到大約250 bp的目標(biāo)小片段，而分別用EcoR I和Xho I單酶切只得

7、到了大約5.3×10<'3>bp左右的單一目標(biāo)大片段。質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序分析，表明插入的mBD2基因序列正確，無(wú)突變，閱讀框架也未發(fā)生改變，可以用于后續(xù)試驗(yàn)。 (2) 真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/mBD2、pcDNA3.1(+)/rmBD2 及 pcDNA3.1(+)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SiHa細(xì)胞后，經(jīng)500μL/mL G418濃度篩選30天，分別得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株SiHa/M、SiHa/R、SiHa/K。SiHa/M、SiHa/R細(xì)胞經(jīng)

8、RT-PCR鑒定均有250 bp、220 bp左右目的條帶擴(kuò)增及200 bp左右的β-actin條帶，而SiHa/K細(xì)胞經(jīng)RT-PCR.擴(kuò)增只有200 bp左右的β-actin條帶。Western Blot結(jié)果顯示SiHa/M、 SiHa/R組在大約4～6KD區(qū)域出現(xiàn)目標(biāo)條帶。免疫熒光染色結(jié)果顯示，SiHa/M、SiHa/R組在胞內(nèi)有熒光存在，對(duì)照組SiHa/K和SiHa未見(jiàn)熒光。細(xì)胞活力分析結(jié)果結(jié)果表明，SiHa/M、SiHa/R組細(xì)

9、胞在貼壁后2～3天細(xì)胞活性明顯低于SiHa/K組及未轉(zhuǎn)染的SiHa細(xì)胞(P<0.05)；但隨著時(shí)間推移，細(xì)胞活性開(kāi)始下降，四組細(xì)胞細(xì)胞活力無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。采用Annexin V檢測(cè)方法觀察細(xì)胞凋亡，SiHa/M、SiHa/R及SiHa組Annexin V<'+>/PI<'+>雙陽(yáng)性細(xì)胞的百分率分別為2.4％、2.3％、2.3％：Annexin V<'+>/PI<'->細(xì)胞分別為0.9％、1.2％、1.5％；三組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)

10、意義，P>0.05。 TLINEL染色結(jié)果可見(jiàn)SiHa/M、SiHa/R兩組細(xì)胞凋亡發(fā)生指數(shù)較高，分別達(dá)到40.7％、30.2％，而SiHa對(duì)照組細(xì)胞凋亡率只有7.3％，實(shí)驗(yàn)組與 SiHa 對(duì)照組之間的意義有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05：而且SiHa/M與SiHa/R組之間的差別也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05。 (3) 成功建立了裸鼠宮頸癌移植瘤模型。腫瘤生長(zhǎng)曲線顯示：SiHa/K組與SiHa.組腫瘤生長(zhǎng)迅速，兩組相同時(shí)間點(diǎn)腫瘤直徑

11、差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P>0.05；SiHa/M與SiHa/R組腫瘤生長(zhǎng)較緩慢，與SiHa組、SiHa/K相同時(shí)間點(diǎn)腫瘤直徑組比較，差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05。SiHa/M與SiHa/R組相同時(shí)間點(diǎn)腫瘤直徑相比較，P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。腫瘤組織HE染色結(jié)果顯示，SiHa/M與SiHa/R細(xì)胞生長(zhǎng)不活躍，局部有出血壞死，病理性核分裂相少；SiHa/K組與SiHa組腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)活躍，病理性核分裂相多見(jiàn)，瘤細(xì)胞侵犯周圍脂肪及肌肉組織。免

12、疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示SiHa/M與 SiHa/R.組有mBD2表達(dá)：由TIJNEL染色結(jié)果可以看出，SiHa/M與SiHa/R.組細(xì)胞凋亡較多，而SiHa/K 及 SiHa組細(xì)胞凋亡少，兩者之間的意義有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05。 (4) 成功建立了BALB/c 小鼠 U14 移植瘤模型。采用無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/mBD2、peDNA3.1(+)/rmBD2、pcDNA3.1(+)治療造模成功的荷瘤小鼠，治療結(jié)果顯

13、示：pcDNA組及PBS組腫瘤呈彌漫型侵襲性生長(zhǎng)，腫瘤生長(zhǎng)迅速，出現(xiàn)大范圍出血、壞死，侵犯周圍組織，在治療后陸續(xù)出現(xiàn)死亡，并至第7天全部死亡；mBD2組與 rmBD2組小鼠腫瘤生長(zhǎng)相對(duì)緩慢，出現(xiàn)局部出血壞死等現(xiàn)象，至治療2周，才開(kāi)始出現(xiàn)死亡，至治療結(jié)束時(shí)，每組仍有3只小鼠存活，而Pt組小鼠腫瘤生長(zhǎng)慢，小鼠生長(zhǎng)較為活躍，至治療21天，開(kāi)始出現(xiàn)死亡，peDNA和PBS組與mBD2組和rmBD2組及Pt組與mBD2組和rmBD2組生存時(shí)間比較

14、，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05，mBD2組和rmBD2生存時(shí)間比較，也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。存活小鼠生長(zhǎng)狀態(tài)良好，較活躍。mBD2組與rmBD2組腫瘤組織有mBD2蛋白表達(dá)，其余三組未見(jiàn)有陽(yáng)性信號(hào)出現(xiàn)。mBD2組和rmBD2組外周血中T細(xì)胞總數(shù)明顯減少，但 CD4<'+>/CD8<'+>比值大于2，可能與mBD2治療作用有關(guān)。此外，外周血瑞氏染色結(jié)果顯示中性粒細(xì)胞明顯增加，可能與腫瘤病程后期類白細(xì)胞反應(yīng)有關(guān)。 結(jié)論： (1)

15、 采用RT-PCR.方法成功擴(kuò)增了mBD2基因全長(zhǎng)序列，并將該基因序列插入pcDNA3.1(+)，成功構(gòu)建了真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/mBD2。 (2) 利用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株成功建立裸鼠宮頸癌移植瘤模型。并采用小鼠宮頸癌細(xì)胞U14建立了BALB/c小鼠宮頸癌移植瘤模型。 (3) 通過(guò)培養(yǎng)的細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，mBD2能夠抑制SiHa的生長(zhǎng)和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。通過(guò)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，證實(shí)mBD2能夠抑制移植瘤的生長(zhǎng)，延長(zhǎng)荷