茶樹糖類相關(guān)基因的挖掘及其在茶樹冷馴化中的表達(dá)研究.pdf

1、糖作為生命有機(jī)體的重要能量和物質(zhì)來源，在植物生長發(fā)育及逆境脅迫響應(yīng)調(diào)控中具有重要的作用。逆境脅迫下，植物通過調(diào)節(jié)體內(nèi)糖的分配，維持細(xì)胞的滲透勢、氧化還原水平等的平衡;糖還作為信號分子調(diào)控逆境相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，從而提高植物對逆境的抵御能力。冷馴化作用誘導(dǎo)茶樹中糖的積累，與茶樹抗寒能力的提高密切相關(guān)。然而，糖的代謝、運(yùn)輸和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受大量酶的調(diào)控，從酶學(xué)水平上研究糖在茶樹抗寒中的作用機(jī)制困難較大。前期的研究發(fā)現(xiàn)碳水化合物相關(guān)基因在茶樹冷馴化過程

2、中的表達(dá)差異顯著。因此，從基因水平上研究糖相關(guān)的酶基因的表達(dá)調(diào)控，有助于進(jìn)一步揭示糖介導(dǎo)的茶樹抗寒響應(yīng)機(jī)理。本研究首先分析了冷馴化作用對茶樹中主要糖含量等的影響;其次克隆了茶樹中糖代謝、轉(zhuǎn)運(yùn)及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的基因，共72個，對它們的生物信息學(xué)進(jìn)行了詳細(xì)的分析，并用熒光定量PCR(qRT-PCR)研究了它們在茶樹自然冷馴化中的表達(dá)模式。為揭示糖介導(dǎo)的茶樹抗寒機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:
　　1.冷馴化過程中，茶樹中的淀粉含量

3、降低，蔗糖、葡萄糖等可溶性糖含量升高，同時脯氨酸和丙二醛等也發(fā)生改變，茶樹抗寒能力的提高。電鏡觀察顯示，冷馴化對茶樹葉綠體結(jié)構(gòu)的影響較明顯。淀粉代謝、蔗糖代謝等通路與茶樹冷馴化密切相關(guān)。
　　2.淀粉代謝與植物抗寒響應(yīng)密切相關(guān)。在淀粉代謝途徑中，克隆了茶樹中2個淀粉合成酶基因（CsSS3和CsSS4）、9個β-淀粉酶家族基因（CsBAM1-9）、3個α-淀粉酶家族基因（CsAMY1-3），以及麥芽糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白CsMEX1基因和麥芽糖

4、轉(zhuǎn)葡萄糖基酶CsDPE2基因。分析了它們的生物信息學(xué)特征，熒光定量PCR檢測了這些基因在茶樹自然冷馴化中的表達(dá)模式。冷馴化調(diào)控茶樹中淀粉代謝相關(guān)基因表達(dá)，提高β-淀粉酶活性變化。克隆了1515bp的CsBAM3啟動子區(qū)，分析顯示含多種逆境響應(yīng)元件，并對CsBAM3進(jìn)行了原核表達(dá)分析。
　　3.逆境脅迫下，可溶性糖，如蔗糖、海藻糖和RFO等含量提高能夠保護(hù)植物免受脅迫的傷害。在他們的合成通路中，克隆了28個基因。分析了這些基因編碼的

5、蛋白質(zhì)理化性質(zhì)、蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)發(fā)育等生物信息學(xué)特征。基因表達(dá)顯示，糖代謝的基因受低溫誘導(dǎo)，特別是CsINV5等能夠被顯著上調(diào)表達(dá)?？寺×瞬铇銫sINV5啟動子區(qū)930 bp的序列，分析顯示其含有低溫等脅迫響應(yīng)的元件。
　　4.糖的分配受糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的調(diào)控，從而影響植物對逆境的響應(yīng)。我們從茶樹中克隆了包括SUTs、ERD6-like、SWEETs、TMTs等7種不同類型的糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因20個。生物信息學(xué)分析顯示，它們均含有糖轉(zhuǎn)運(yùn)

6、蛋白典型的跨膜螺旋結(jié)構(gòu)。冷馴化過程中，大部分轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因上調(diào)表達(dá)，參與糖輸出的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)被抑制，它們可能調(diào)控了低溫馴化中糖的分配。
　　5.己糖激酶(HXK)和蔗糖非發(fā)酵-1相關(guān)蛋白激酶1(SnRK1)是植物糖信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的重要調(diào)控元件，我們在茶樹中分別克隆3個HXK基因（CsHXK1-3）和3個SnRK1基因（Cs SnRK1.1-1.3），同時還分離了CsSnRK2.6和CsSnRK2.8兩個逆境脅迫響應(yīng)基因。在冷馴