鐵線蕨總DNA提取及其轉(zhuǎn)基因研究.pdf

1、以鐵線蕨為研究材料，首先對其總DNA提取方法進行改良，并證明了改良方法的優(yōu)越性；其次分別建立了鐵線蕨孢子體與配子體的再生體系，并通過農(nóng)桿菌介導法與基因槍法對其進行了轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灒瑥亩接懘嗽偕w系基礎上進行的鐵線蕨轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灥目尚行浴?br>　　 主要研究結(jié)果如下：
　　 1.蕨類植物因含有高酚、高糖等次生代謝物而使其總DNA的提取難度大于其它植物。以鐵線蕨孢子體世代與配子體世代植株為材料，采用9種不同方法提取總DNA，并通過檢

2、測體系對所得總DNA進行分析。結(jié)果表明：結(jié)構簡單的配子體為材料獲得的鐵線蕨總DNA的純度明顯高于孢子體，但是產(chǎn)量也明顯低于孢子體；對于配子體而言，CTAB法、SDS法、高鹽低pH法、尿素提取法、試劑盒法都能提取到較為純凈的總DNA，但經(jīng)過DNA完整性檢測體系篩選后，改良CTAB法結(jié)果最優(yōu)；對于含大量次生代謝產(chǎn)物的孢子體植株而言，改良CTAB法得到的總DNAg巨度明顯高于其它，通過后續(xù)的DNA完整性檢測得到與配子體相同結(jié)論。
　　

3、 2.鐵線蕨再生體系的建立。以鐵線蕨孢子體植株拳卷葉或初伸展的羽葉為材料，光照條件選擇12h光照/12h黑暗，首先在0.5mg/L6-BA+0.5mg/L2，4-D(或1 mg/L2，4-D)的MS培養(yǎng)基中初步誘導產(chǎn)生緊密型愈傷組織，后將其繼續(xù)在同樣培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，當繼代3～4代后轉(zhuǎn)移到0.5mg，L6-BA或1 mg/L6-BA的MS培養(yǎng)基中誘導體細胞胚再生，之后轉(zhuǎn)移至不含激素的MS培養(yǎng)基上誘導再生孢子體小苗，確定鐵線蕨孢子體誘導愈

4、傷組織的再分化體系。以鐵線蕨孢子為材料，其萌發(fā)以紅光誘導2 d為最佳，在實驗室條件下其生長周期主要劃分為以下6個時期：孢子，孢子萌發(fā)，心形原葉體時期，精子器、頸卵器發(fā)育期，幼小孢子體植株，成熟孢子體植株產(chǎn)生孢子，確定為鐵線蕨配子體再生體系。
　　 3.通過農(nóng)桿菌介導法與基因槍法對鐵線蕨進行轉(zhuǎn)基因初探。研究結(jié)果表明：兩種方法在對鐵線蕨不同材料進行轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灪?，已長出精子器和頸卵器的原葉體均表現(xiàn)出較高的敏感性，通過GFP檢測得到最多