轉(zhuǎn)基因食品DNA提取及寡核苷酸芯片檢測(cè)技術(shù)的研究.pdf

1、轉(zhuǎn)基因生物(Genetically Modified Organism，GMO)是利用現(xiàn)代分子生物技術(shù)，將某些生物的基因轉(zhuǎn)移到其他物種中，改造生物的遺傳物質(zhì)，使其在形狀、營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)、消費(fèi)品質(zhì)等方面向人們所需要的目標(biāo)轉(zhuǎn)變。以轉(zhuǎn)基因生物為直接食品或?yàn)樵霞庸どa(chǎn)的食品就是“轉(zhuǎn)基因食品(Genetically Modified Foods，GMF)”。
　　 隨著基因工程技術(shù)的日趨成熟及在農(nóng)產(chǎn)品上的廣泛應(yīng)用，轉(zhuǎn)基因食品應(yīng)運(yùn)而生，并以驚人

2、的速度進(jìn)入人們的生活。2011年全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積達(dá)1.6億公頃，比1996年的170萬(wàn)公頃增長(zhǎng)94倍，而以轉(zhuǎn)基因作物為原材料加工的食品已達(dá)上萬(wàn)種。轉(zhuǎn)基因食品給人類帶來(lái)了豐富的食品供應(yīng)和巨大的經(jīng)濟(jì)效益，但到目前為止，轉(zhuǎn)基因食品對(duì)人類健康的安全性一直受人們質(zhì)疑。某些轉(zhuǎn)基因食品引起中毒、過(guò)敏反應(yīng)、降低人體抵御病毒的能力、改變機(jī)體腸道菌群平衡等危害已有報(bào)道。為了維護(hù)消費(fèi)者的知情權(quán)和選擇權(quán)，世界上的很多國(guó)家和地區(qū)先后出臺(tái)了相應(yīng)的法律和管理方

3、法，對(duì)轉(zhuǎn)基因食品實(shí)行強(qiáng)制標(biāo)識(shí)或自愿標(biāo)識(shí)。2002年我國(guó)農(nóng)業(yè)部頒布的《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)識(shí)管理辦法》，規(guī)定對(duì)5大類17種產(chǎn)品必須進(jìn)行標(biāo)識(shí)。
　　 對(duì)轉(zhuǎn)基因食品進(jìn)行標(biāo)識(shí)基于能檢測(cè)到轉(zhuǎn)基因成分。因此建立準(zhǔn)確、快速、高效的轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)技術(shù)至關(guān)重要，而高質(zhì)量DNA模板的獲取，是轉(zhuǎn)基因食品進(jìn)行基因檢測(cè)的前提和關(guān)鍵。
　　 核酸提取包含樣品的裂解和純化兩大步驟。裂解是使樣品中的核酸游離在裂解體系中的過(guò)程，純化則是使核酸與裂解體系中的其

4、它成分，如蛋白質(zhì)、多糖、鹽等雜質(zhì)徹底分離去除的過(guò)程。裂解方法包括化學(xué)裂解法（表面活性劑SDS、CTAB、高鹽等）、酶裂解法（蛋白酶K、溶菌酶、裂解酶等）和機(jī)械裂解法（研磨等）。最常用的純化方法，一是有機(jī)溶劑抽提再沉淀，二是介質(zhì)純化。介質(zhì)純化是利用某些固相介質(zhì)，在特定的條件下選擇性吸附的特點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)核酸與蛋白質(zhì)及其他雜質(zhì)的分離。
　　 由于加工食品成分復(fù)雜，DNA破壞降解嚴(yán)重，因此從加工食品中提取DNA，潛在困難很大。目前國(guó)內(nèi)外很多

5、學(xué)者在積極探索、深入研究各種高效的轉(zhuǎn)基因食品DNA提取方法。本研究針對(duì)轉(zhuǎn)基因食品的不同加工程度，構(gòu)建和優(yōu)化了各種加工程度的食品DNA的提取方法。
　　 首先，對(duì)于轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品，采用Chelex-100法快速提取轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品DNA，Chelex-100是一種由苯乙烯和苯二乙烯共聚體組成的化學(xué)離子螯合樹(shù)脂，其懸液在堿性環(huán)境(pH10～11)和100℃的條件下，可導(dǎo)致細(xì)胞破裂，DNA從細(xì)胞核中釋放，同時(shí)Chelex-100能結(jié)合許多可

6、能影響下一步分析的非核酸物質(zhì)。由于Chelex-100能有效除去非核酸有機(jī)物，并且通過(guò)結(jié)合金屬離子，防止DNA降解，具有經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便、高效等優(yōu)點(diǎn)，目前已被廣泛用于從微量血液、組織斑塊、精斑、骨骼等法醫(yī)物證檢材。本研究比較國(guó)標(biāo)（GB/T19495.3-2004）CTAB-1法和Chelex-100法提取轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2 DNA濃度和純度，對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果顯示Chelex-100法提取的DNA濃度較國(guó)標(biāo)CTAB-1法

7、高(t濃度=10.424，P濃度=0.000)，而純度較CTAB-1法低（t純度=12.684，P純度=0.000），但是作為模板用于PCR擴(kuò)增，效果與CTAB-1提取方法并無(wú)明顯差別;對(duì)比兩種方法提取的DNA在-20℃下保存一個(gè)月內(nèi)的PCR檢測(cè)效果，結(jié)果未見(jiàn)明顯差別;將Chelex-100法應(yīng)用于其他農(nóng)產(chǎn)品的DNA提取，效果理想。
　　 其次，對(duì)于輕中度加工食品，采用改良傳統(tǒng)的CTAB法。CTAB法是提取植物DNA的經(jīng)典方法，

8、也是文獻(xiàn)報(bào)道最多的提取轉(zhuǎn)基因食品DNA的方法，但是傳統(tǒng)的CTAB法由于操作繁瑣，耗時(shí)長(zhǎng)，試劑組成復(fù)雜，酚、氯仿等有機(jī)溶劑易造成環(huán)境污染等問(wèn)題，在使用上受到一定的限制。本研究改良傳統(tǒng)CTAB法，利用硅膜吸附柱純化DNA，減少應(yīng)用氯仿等有毒的有機(jī)溶劑，大大縮短了操作時(shí)間，比較該方法與國(guó)標(biāo)(GB/T19495.3-2004) CTAB-1法提取轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2 DNA的濃度和純度，對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果顯示改良CTAB法提

9、取的DNA濃度和純度均較國(guó)標(biāo)CTAB-1法高(t濃度=9.471，P濃度=0.001;t純度=3.253，P純度=0.031)，差異具有顯著性意義，表明該方法提取的DNA效果較理想，同時(shí)將其應(yīng)用于輕中度加工食品的DNA提取中，取得理想效果。
　　 第三，針對(duì)油脂經(jīng)過(guò)深加工，DNA含量低，且受破壞嚴(yán)重，提取難度大的特點(diǎn)，本研究利用硅膜吸附柱為介質(zhì)，結(jié)合DNA擔(dān)體鮭魚(yú)精子DNA，建立了一種穩(wěn)定有效的從食用油中提取DNA的方法，將其應(yīng)

10、用于5個(gè)品牌11種食用油的DNA提取，核酸進(jìn)行定性PCR、LAMP、熒光定量PCR檢測(cè)，效果理想。
　　 最后，高質(zhì)量DNA模板的提取是轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)的前提與關(guān)鍵，而轉(zhuǎn)基因成分的檢測(cè)是最終目標(biāo)。目前轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)包括基于外源蛋白質(zhì)靶標(biāo)的蛋白質(zhì)檢測(cè)方法和基于核酸水平的檢測(cè)方法。由于蛋白質(zhì)檢測(cè)成本高，所需時(shí)間長(zhǎng)，加上蛋白質(zhì)對(duì)熱敏感，加熱過(guò)程中容易變性，經(jīng)過(guò)加工的轉(zhuǎn)基因食品，絕大部分蛋白質(zhì)變性，檢出率較低，現(xiàn)在該類檢測(cè)實(shí)際工作中較少涉

11、及。核酸水平的檢測(cè)包括PCR技術(shù)、基因芯片技術(shù)檢測(cè)等。單純的PCR檢測(cè)技術(shù)有容易污染、易出現(xiàn)假陽(yáng)性等缺點(diǎn)。基因芯片技術(shù)是近年來(lái)在生命科學(xué)領(lǐng)域興起的一項(xiàng)生物高新技術(shù)，具有快速、敏感、準(zhǔn)確、高通量等特點(diǎn)，可對(duì)大樣本的樣品進(jìn)行篩查及鑒定。靶基因的標(biāo)記是基因芯片實(shí)驗(yàn)流程的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，多重PCR擴(kuò)增標(biāo)記是在多重PCR擴(kuò)增過(guò)程中加入熒光標(biāo)記，在擴(kuò)增的同時(shí)進(jìn)行熒光標(biāo)記，特異性高。多重PCR與基因芯片整合可以實(shí)現(xiàn)兩種技術(shù)的優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，通過(guò)PCR的擴(kuò)增標(biāo)

12、記作用和芯片的熒光探針雜交技術(shù)可使此種檢測(cè)體系達(dá)到較高的靈敏度和特異度。本研究針對(duì)轉(zhuǎn)基因食品5大物種13個(gè)品系的篩選基因、目的基因、內(nèi)源基因、轉(zhuǎn)化體特異性基因設(shè)計(jì)特異性引物和探針，建立了5大物種13個(gè)品系的轉(zhuǎn)基因食品基于多重PCR的寡核苷酸基因芯片方法檢測(cè)方法，對(duì)各個(gè)品系轉(zhuǎn)基因食品標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè)，達(dá)到較理想檢測(cè)效果。
　　 本課題通過(guò)實(shí)驗(yàn)室研究，得到以下實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　 1、探究了一種經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便、快速的DNA提取方法——

13、Chelex-100法，適合于轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品的大規(guī)模篩選和鑒別;
　　 2、改良傳統(tǒng)CTAB法，利用硅膜吸附柱純化DNA，減少應(yīng)用有毒的有機(jī)溶劑，大大縮短了操作時(shí)間，將其應(yīng)用于輕中度加工食品的DNA提取中，取得理想效果;
　　 3、構(gòu)建了一種效果佳、通用性好、性價(jià)比高的油脂DNA提取方法，穩(wěn)定有效地從食用油中提取DNA;
　　 4、在芯片的探針設(shè)計(jì)、樣品擴(kuò)增標(biāo)記和雜交過(guò)程中，引入多種探針及樣品作為內(nèi)、外質(zhì)量控制，有

14、效的防止了檢測(cè)應(yīng)用中假陽(yáng)性、假陰性結(jié)果的產(chǎn)生;
　　 5、采用多重PCR法進(jìn)行基因組擴(kuò)增標(biāo)記，完成了芯片的實(shí)驗(yàn)室測(cè)試，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明多重PCR擴(kuò)增標(biāo)記技術(shù)是一項(xiàng)良好的DNA標(biāo)記技術(shù);
　　 6、針對(duì)5大物種13個(gè)品系轉(zhuǎn)基因作物設(shè)計(jì)了26條寡核苷酸探針，制備轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)基因芯片，對(duì)各個(gè)品系標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)品符合率達(dá)100％，表明該芯片能初步應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因樣品的篩查與檢測(cè)。
　　 綜上所述，轉(zhuǎn)基因食品DNA的

15、提取和純化是轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)的基礎(chǔ)與前提，建立一套系統(tǒng)、完善的轉(zhuǎn)基因食品的DNA提取方法至關(guān)重要。根據(jù)不同加工程度的轉(zhuǎn)基因食品建立的轉(zhuǎn)基因食品DNA提取方法具有針對(duì)性好、效率高、效果穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，所提取的DNA能滿足定性PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、LAMP和基因芯片檢測(cè)等分子生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)需求?；诙嘀豍CR的轉(zhuǎn)基因食品寡核苷酸基因芯片檢測(cè)方法，綜合利用了多重PCR的高效率擴(kuò)增標(biāo)記和基因芯片具有大規(guī)模、高通量、高度敏感與高度特異性等特點(diǎn)，可以