奶牛乳腺炎中成纖維細胞分泌的SDF-1對乳腺上皮細胞的作用及機制研究.pdf

1、奶牛乳腺炎是由于奶牛機體代謝和生理狀態(tài)改變、乳房損傷及接觸傳染性或環(huán)境性病原微生物等引起的乳腺炎癥反應。大量的文獻已經(jīng)證實乳腺組織中的乳腺上皮細胞、巨噬細胞、中性粒細胞、淋巴細胞等組成了乳腺組織的細胞免疫系統(tǒng)，共同參與乳牛乳腺炎的免疫應答。成纖維細胞是乳腺組織中數(shù)量最多的基質(zhì)細胞，但其在奶牛乳腺炎和乳腺炎遷延不愈導致乳腺纖維化中的作用及機制尚不明確。本研究通過對比從奶牛炎性乳腺組織中分離的成纖維細胞（inflammatoryfibrob

2、lasts，INFs）和從正常乳腺組織分離的成纖維細胞(normalfibroblasts，NFs)的細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）蛋白和炎癥相關(guān)因子的表達或分泌水平等基本生物學特性的差異，明確基質(zhì)成纖維細胞是否參與在奶牛乳腺炎疾病過程中;并進一步研究了在INFs中表達明顯上調(diào)的基質(zhì)衍生因子1(stromal cell derived factor-1，SDF-1)對奶牛乳腺上皮細胞生物學功能的影響及機制

3、，進而探究成纖維細胞在乳腺炎以及乳腺纖維化發(fā)生發(fā)展過程中的作用，這一研究對奶牛乳腺炎及纖維化的防治具有重要的意義。
　　本研究首先運用實時定量聚合酶鏈反應(qRCR)和蛋白印跡技術(shù)(Western blot)檢測ECM蛋白Ⅰ型膠原蛋白(Collagen-1)、波形蛋白(Vimentin)及基質(zhì)金屬蛋白酶-1(MMP-1)基因水平和蛋白水平的表達;通過qRCR和酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)分別檢測了細胞因子和趨化因子IL-8、CX

4、CL2和SDF-1的基因和蛋白水平的表達;通過細胞劃痕實驗檢測兩種成纖維細胞的遷移能力;利用代表大腸桿菌毒力成分的脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）和代表金黃色葡萄球菌毒力成分的脂磷壁酸(lipoteichoicacid，LTA)建立體外的誘導的成纖維細胞模型檢測ECM相關(guān)蛋白，細胞因子和趨化因子的蛋白水平表達。通過以上從不同角度對INFs和NFs生物學特性的對比，明確成纖維細胞是否參與奶牛乳腺的炎癥過程。然后，通

5、過建立成纖維細胞和乳腺上皮細胞的體外間接共培養(yǎng)模式，研究INFs對乳腺上皮細胞形態(tài)變化及EMT(epithelial-mesenchymaltransition)標志分子如α平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)和角蛋白(Cytokeratin)表達的影響;并進一步通過一系列分子生物學的方法研究了在INFs中高表達的SDF-1對乳腺上皮細胞的影響及分子機制。最后，通過建立SDF-1誘導的體外乳腺炎小鼠模

6、型驗證SDF-1的促炎性和促纖維化作用。
　　結(jié)果顯示，Collagen-1、Vimentin、MMP-1等ECM蛋白和IL-8、CXCL2和SDF-1等炎性相關(guān)因子在INFs、LPS以及LTA誘導的成纖維細胞中的表達或分泌水平均明顯高于NFs，表明成纖維細胞參與在奶牛乳腺的炎癥應答過程。體外共培養(yǎng)結(jié)果顯示，INFs可誘導乳腺上皮細胞的形態(tài)從鋪路石樣轉(zhuǎn)變?yōu)樗笮?，并促進EMT標志分子α-SMA和Cytokeratin的表達，表明在共

7、培養(yǎng)條件下，INFs可誘導乳腺上皮細胞發(fā)生EMT。
　　進一步的研究發(fā)現(xiàn)，LPS和LTA處理后的NFs，以及炎性乳腺組織中SDF-1的表達或分泌都高于正常對照組。外源性SDF-1通過激活NF-κB通路促進乳腺上皮細胞發(fā)生EMT，誘導炎癥反應并抑制細胞增殖。此外，體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)SDF-1在小鼠乳腺中能夠誘發(fā)乳腺炎和輕微的纖維化，而SDF-1的特異性抑制劑可以減輕這一現(xiàn)象，結(jié)果表明INFs分泌SDF1介導其對乳腺上皮細EMT和炎性誘導過