白藜蘆醇抵御奶牛乳腺上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激的作用機(jī)制研究.pdf

1、乳腺上皮細(xì)胞是乳汁合成的主要場(chǎng)所，與乳產(chǎn)量和乳品質(zhì)密切相關(guān)。乳腺上皮細(xì)胞在生理及病理階段，易發(fā)生氧化應(yīng)激。抵御乳腺上皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激和增強(qiáng)其抗氧化能力是維持乳腺健康和高效泌乳的有效手段。白藜蘆醇是一種高效的抗氧化劑，大量研究發(fā)現(xiàn)了它的保健和治療功效，然尚無(wú)研究將其用于健康的乳腺抗氧化研究。本研究首先采用H2O2刺激MAC-T細(xì)胞構(gòu)建了奶牛乳腺上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激模型，評(píng)價(jià)了白藜蘆醇抵御乳腺上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激的效果。然后利用分子生物學(xué)手段探索了

2、白藜蘆醇通過(guò)Nrf2-ARE信號(hào)通路、MAPK及PI3K/AKT等信號(hào)通路對(duì)乳腺上皮細(xì)胞抵御氧化應(yīng)激的保護(hù)作用機(jī)理。最后通過(guò)向哺乳期ICR小鼠日糧中添加低劑量及高劑量的白藜蘆醇檢測(cè)白藜蘆醇在哺乳期飼喂的安全性，并明確其對(duì)乳腺的氧化還原平衡及對(duì)Nrf2-ARE信號(hào)通路的調(diào)控作用。主要研究結(jié)果如下:
　　1.白藜蘆醇保護(hù)奶牛乳腺上皮細(xì)胞抵御H2O2誘導(dǎo)的氧化損傷
　　1.1構(gòu)建H2O2誘導(dǎo)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激模型。采用了不

3、同濃度不同時(shí)間的H2O2刺激MAC-T檢測(cè)細(xì)胞增殖、細(xì)胞死亡率、ROS蓄積情況、細(xì)胞的氧化平衡情況、細(xì)胞內(nèi)線粒體損傷（BAX和BCL2）和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)損傷指標(biāo)（GPR78和CHOP）基因的表達(dá)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)500μMH2O2處理MAC-T細(xì)胞24 h可以引起顯著地細(xì)胞活力損失，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡發(fā)生，處理MAC-T細(xì)胞12 h引起顯著地ROS過(guò)量產(chǎn)生，并伴隨著總抗氧能力和超氧化物歧化酶活性的下降，500μMH2O2處理導(dǎo)致GPR78和CHOP基因表

4、達(dá)在4h達(dá)到最大，BAX/BCL2最大值則在24h出現(xiàn)。由此確定500μM以上H2O2處理MAC-T細(xì)胞引起細(xì)胞氧化損傷，主要表現(xiàn)為細(xì)胞活力損傷、細(xì)胞死亡加劇、氧化還原平衡被破壞，并伴隨著線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)損傷，并在后續(xù)研究中采用500μM H2O2處理MAC-T細(xì)胞構(gòu)建氧化應(yīng)激損傷模型。
　　1.2明確白藜蘆醇對(duì)H2O2誘導(dǎo)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)效果。采用不同濃度白藜蘆醇處理MAC-T細(xì)胞確定MAC-T24 h內(nèi)能夠耐受的

5、白藜蘆醇的最高濃度是50μM。接著基于前期構(gòu)建的氧化應(yīng)激模型，采用50μM以下不同濃度的白藜蘆醇或溶劑對(duì)照預(yù)處理2h而后加入H2O2或PBS的處理特定時(shí)間來(lái)檢測(cè)細(xì)胞增殖、細(xì)胞死亡率、ROS蓄積情況、細(xì)胞的氧化平衡情況、細(xì)胞內(nèi)線粒體損傷（BAX和BCL2）和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)損傷指標(biāo)（GPR78和CHOP）基因的表達(dá)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，較之H2O2處理，白藜蘆醇預(yù)處理后再加入H2O2的細(xì)胞活力損失、細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞內(nèi)的ROS蓄積程度隨白藜蘆醇的濃度的增加

6、而下降。而且白藜蘆醇的添加增加了細(xì)胞的總抗氧化能力。50μM白藜蘆醇削弱了H2O2誘導(dǎo)的線粒體損傷和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)損傷。結(jié)果顯示白藜蘆醇可以保護(hù)乳腺上皮細(xì)胞抵御H2O2誘導(dǎo)的氧化損傷
　　2.白藜蘆醇保護(hù)乳腺上皮細(xì)胞抵御H202誘導(dǎo)的氧化損傷的作用機(jī)制
　　2.1檢測(cè)白藜蘆醇及H2O2處理對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞中Nrf2-ARE-抗氧化酶鏈的作用。首先檢測(cè)白藜蘆醇和H2O2單獨(dú)/組合處理MAC-T后細(xì)胞內(nèi)的抗氧化關(guān)鍵基因TXNRD1、H

7、O-1、XCT、NQO-1的表達(dá)豐度變化，發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇預(yù)處理后無(wú)論是否有H2O2刺激，細(xì)胞內(nèi)的抗氧化關(guān)鍵基因表達(dá)在特定的時(shí)間內(nèi)均被激活表達(dá)，且較之H2O2單獨(dú)處理組，白藜蘆醇+ H2O2處理的抗氧化基因均在8h顯著增強(qiáng)。采用不同濃度白藜蘆醇處理細(xì)胞后加入H2O2刺激發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇對(duì)于抗氧化基因的表達(dá)具有劑量依賴性，有報(bào)道證實(shí)這些基因是Nrf2-ARE信號(hào)通路的靶基因。接著我們檢測(cè)發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇促進(jìn)了H2O2處理下Nrf2蛋白的核轉(zhuǎn)移程度，并

8、促進(jìn)了細(xì)胞內(nèi)的ARE原件的激活。由此證實(shí)白藜蘆醇激活了細(xì)胞內(nèi)的Nrf2-ARE-抗氧化鏈。
　　2.2明確白藜蘆醇依賴Nrf2發(fā)揮奶牛乳腺細(xì)胞保護(hù)作用。通過(guò)siRNA沉默Nrf2基因表達(dá)后重新評(píng)估白藜蘆醇的保護(hù)效果，研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)的Nrf2-ARE-抗氧化鏈的關(guān)鍵靶基因表達(dá)在H2O2和白藜蘆醇+H2O2處理中均被抑制。而且siRNA沉默Nrf2基因表達(dá)后白藜蘆醇預(yù)處理不能保護(hù)細(xì)胞免受H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞活力損失，甚至siRNA沉默N

9、rf2基因表達(dá)后H2O2處理導(dǎo)致的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激加劇。由此得出白藜蘆醇是通過(guò)Nrf2-ARE信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)保護(hù)乳腺上皮細(xì)胞的作用的。
　　2.3探索白藜蘆醇通過(guò)MAPK、PI3K/AKT信號(hào)通路對(duì)Nrf2-ARE信號(hào)通路激活的作用。檢測(cè)白藜蘆醇及H2O2單獨(dú)/組合處理MAC-T后細(xì)胞內(nèi)AKT、ERK1/2、JNK1/2、p38的磷酸化水平的時(shí)間劑量作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)H2O2單獨(dú)處理激活了所有上述信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)關(guān)鍵蛋白的活化，而白藜蘆醇預(yù)處理則延長(zhǎng)

10、了AKT及ERK1/2的磷酸化時(shí)間。后期采用抑制劑預(yù)處理抑制細(xì)胞內(nèi)PI3K/AKT、ERK1/2、JNK1/2、p38信號(hào)通路的激活，再采用白藜蘆醇及H2O2單獨(dú)/組合處理發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可能是通過(guò)EKR、PI3K/AKT信號(hào)通路激活Nrf2-ARE信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)保護(hù)乳腺上皮細(xì)胞的作用，而p38信號(hào)通路則抑制了白藜蘆醇對(duì)Nrf2-ARE信號(hào)通路的激活作用及細(xì)胞保護(hù)作用的發(fā)揮。
　　3.日糧添加白藜蘆醇對(duì)哺乳期小鼠乳腺氧化損傷及生產(chǎn)性能的

11、影響
　　該部分采用單因素多水平試驗(yàn)探索了日糧中添加白藜蘆醇對(duì)哺乳期ICR小鼠乳腺的抗氧化作用，白藜蘆醇的添加劑量為0、0.02％、0.2％。通過(guò)母鼠采食量、體重、器官分?jǐn)?shù)、乳腺重量變化發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇的添加不會(huì)對(duì)母鼠這些指標(biāo)造成負(fù)面影響，通過(guò)間接法評(píng)估乳產(chǎn)量也未發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇具有促進(jìn)乳產(chǎn)量的作用。對(duì)仔鼠的窩重，日增重及器官發(fā)育分?jǐn)?shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇不會(huì)對(duì)仔鼠以上發(fā)育指標(biāo)產(chǎn)生負(fù)面作用，提示哺乳期食入一定劑量白藜蘆醇是安全的。
　　通

12、過(guò)采集母鼠的乳腺、肝臟、腎臟等器官檢測(cè)器官總抗氧化能力、脂質(zhì)過(guò)氧化物、超氧化物歧化酶酶活力，發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇的添加顯著降低了泌乳期ICR小鼠乳腺中的脂質(zhì)過(guò)氧化程度，減少氧化損傷，而對(duì)肝臟和腎臟則無(wú)上述效果。同時(shí)對(duì)乳腺的抗氧化基因mRNA表達(dá)的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，0.2％白藜蘆醇添加的小鼠乳腺中SOD2、GPX1、PRX1、TXNRD1的基因表達(dá)顯著上調(diào)，而0.02％以上的白藜蘆醇添加小鼠乳腺中TXNRD1、HO1、Nrf2蛋白表達(dá)均顯著上調(diào)，提示日糧

13、添加白藜蘆醇可以減少哺乳期小鼠乳腺氧化損傷，促進(jìn)Nrf2-ARE-抗氧化鏈信號(hào)通路。
　　綜上所述，本研究成功構(gòu)建了奶牛乳腺上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激模型，利用此模型研究了白藜蘆醇在乳腺上皮細(xì)胞中的抗氧化損傷作用及其機(jī)制，并采用在體實(shí)驗(yàn)證實(shí)了白藜蘆醇的乳腺保護(hù)作用及其對(duì)Nrf2-ARE-抗氧化鏈的調(diào)節(jié)作用。其中Nrf2-ARE-抗氧化鏈在乳腺抗氧化應(yīng)激和細(xì)胞存活中發(fā)揮重要作用，白藜蘆醇可能通過(guò)PI3K/AKT、ERK通路影響Nrf2-ARE