我國鼬獾狂犬病病毒分子流行病學研究.pdf

1、鼬獾（Melogale moschata）是一種廣泛分布于我國華東、華南等地的小型鼬科動物，我國關(guān)于鼬獾狂犬病的首次報道，可追溯到上世紀90年代初。此后，在浙江、江西、安徽等地，均有因鼬獾咬傷導致狂犬病發(fā)病死亡的病例發(fā)生，當時的狂犬病診斷均根據(jù)臨床癥狀和流行病學調(diào)查得出，但未進行病原學確診。鼬獾頻繁引起人感染狂犬病的現(xiàn)象表明，鼬獾可能是除犬外，又一重要的狂犬病貯存宿主和傳播宿主，并嚴重危害這些地區(qū)的公共衛(wèi)生安全。國內(nèi)以前關(guān)于野生動物狂犬

2、病流行病學方面的研究缺乏，對于鼬獾狂犬病的研究更不系統(tǒng)，這些地區(qū)鼬獾種群內(nèi)是否存在狂犬病病毒流行，流行毒株與我國現(xiàn)有和歷史流行毒株關(guān)系，以及其可能來源等問題，都需要通過系統(tǒng)的流行病學監(jiān)測、調(diào)查及深入分析研究得以闡明?？刂埔吧鷦游锟袢∽钣行У拇胧┦菍ζ溥M行口服免疫，目前國內(nèi)尚無這方面的研究與報道。
　　針對上述問題，開展以下研究:
　　1.鼬獾狂犬病流行病學監(jiān)測與病毒演化分析。研究內(nèi)容:①鼬獾腦組織樣品的采集與檢測。在江西、

3、浙江等地采集不明原因死亡鼬獾腦組織樣品，并進行直接免疫熒光法檢測。②狂犬病病毒的分離與鑒定。對檢測陽性的樣品，經(jīng)乳鼠腦內(nèi)接種分離病毒。③鼬獾源狂犬病病毒N基因和G基因的擴增及測序。④狂犬病病毒N基因和G基因序列相似性與遺傳演化分析;分析整理獲得的數(shù)據(jù)，使用遺傳分析軟件，對鼬獾源狂犬病病毒序列和我國流行毒株序列進行對比分析，分析鼬獾分離株之間是否存在進化差異，從而確定鼬獾狂犬病在這些地區(qū)流行范圍和趨勢，并分析鼬獾狂犬病與我國犬和人群中流行

4、狂犬病間的關(guān)系。⑤鼬獾源狂犬病病毒N基因演化分析。通過對病毒演化時間推算，揭示其可能來源，評價其公共衛(wèi)生風險，為制定相應(yīng)狂犬病防控對策提供理論依據(jù)。
　　2.鼬獾源狂犬病病毒全基因組測序與分析。研究內(nèi)容:①全基因組序列擴增及測序。根據(jù)N基因（G基因）遺傳進化分析結(jié)果，選取不同分枝毒株(JX09-17(fb)、JX09-18、JX10-37)進行全基因測序。②全基因組序列分析。將不同分枝毒株的全基因組核苷酸和氨基酸序列進行對比，并與

5、其他流行株和疫苗株進行比對，分析各結(jié)構(gòu)蛋白氨基酸發(fā)生突變的位點。
　　3.重組疫苗和弱毒疫苗對鼬獾的口服免疫試驗。研究內(nèi)容:①鼬獾的口服免疫試驗。選取重組疫苗(CAV-2-E3△-RGP)和弱毒疫苗(SRV9)分別口服免疫20只鼬獾。②免疫前及免疫后14天、21天分別對免疫鼬獾采血，按照熒光抗體病毒中和試驗（FAVN）方法，測定狂犬病病毒中和抗體水平。③統(tǒng)計試驗結(jié)果，分析和評價兩種疫苗的免疫效果，并比較是否存在差異。
　　通

6、過以上試驗，獲得以下結(jié)果:
　　1.流行病學調(diào)查與演化分析結(jié)果顯示，通過連續(xù)6年監(jiān)測，共檢測鼬獾腦組織樣品2932份，陽性91份（平均陽性率3.1％），經(jīng)MIT分離獲得91株狂犬病病毒。進化分析表明，這些毒株形成4個進化分枝(CladeA、Clade B、CladeC、CladeD)，對應(yīng)的病毒樣品，來源于不同的地區(qū):CladeA，包括46株病毒，主要分布于浙江千島湖周圍和鄱陽湖以東地區(qū)，與我國狂犬病病毒ChinaⅡ進化關(guān)系較近，

7、處于同一進化分枝;Clade C，有27株病毒，主要分布于鄱陽湖以西地區(qū)，該分枝毒株進化關(guān)系相對獨立，與我國狂犬病病毒ChinaⅠ和ChinaⅡ的進化關(guān)系均較遠;Clade B，8株病毒，分布在江西省撫州地區(qū)，與我國狂犬病病毒ChinaⅠ內(nèi)的犬源分離株核苷酸相似性較高，進化關(guān)系較近;Clade D，10株病毒，該分枝內(nèi)還包括1株浙江省犬源狂犬病病毒，分布于浙江省臺州地區(qū)，與Clade B鼬獾分離株進化關(guān)系較近，同屬我國狂犬病病毒Chin

8、aⅠ，而與Clade A和C鼬獾分離株相似性分別為88％和94％左右。
　　通過病毒演化分析，推測出4個分枝毒株分化時間分別為:Clade A～1941年，Clade B～1990年，Clade C～1937年，Clade D～1997年，從分化時間的早晚及分離毒株的數(shù)量可以看出，分化越早的病毒分枝，其毒株的數(shù)量越多。
　　2.病毒全基因組測序分析結(jié)果顯示，鼬獾分離株(JX10-37株、JX09-17(fb)株和JX09-1

9、8株）與國內(nèi)流行毒株和疫苗株經(jīng)氨基酸比對，分別有53個、23個和25個氨基酸位點發(fā)生突變，這其中有些位點是發(fā)生在狂犬病病毒屬內(nèi)的獨特突變（分別為27個、14個和6個）。JX09-17(fb)株在決定病毒毒力的重要基因位點（G蛋白抗原位點Ⅲ的333位）發(fā)生由精氨酸(R)到谷氨酰胺(Q)的突變。JX10-37株在較保守的G蛋白抗原位點Ⅰ的231位，發(fā)生由亮氨酸(L)到絲氨酸(S)的突變。
　　3.對捕獲后人工飼養(yǎng)的40只鼬獾的口服免疫

10、結(jié)果顯示，免疫后21天，F(xiàn)AVN所測免疫動物的中和抗體均發(fā)生陽轉(zhuǎn)(0.1-4.5 IU/mL)，重組疫苗組和弱毒疫苗組分別有17只（17/20）和16只(16/20)鼬獾，中和抗體高于0.50 IU/mL，達到臨界保護水平。
　　通過以上結(jié)果，得出以下結(jié)論:
　　1.江西、浙江等地鼬獾種群內(nèi)，存在狂犬病的獨立傳播循環(huán);至少有4種不同毒株在流行，呈明顯的地域分布;這4個分枝的病毒在不同時期由犬溢出感染鼬獾，并在鼬獾種群內(nèi)流行;

11、此外，有證據(jù)表明，鼬獾與犬可能發(fā)生交叉?zhèn)鞑ァ?br>　　2.通過對3個不同演化分枝的鼬獾分離株全基因序列分析，進一步發(fā)現(xiàn)了毒株中與毒力相關(guān)基因和演化相關(guān)基因的突變;氨基酸位點突變的多樣與復雜，說明RABV在鼬獾種群內(nèi)流行過程中，逐漸向更適應(yīng)動物的方向發(fā)展，同時也說明鼬獾可能對狂犬病高度易感。
　　3.通過對鼬獾的口服免疫試驗，證明CAV-2-E3-RGP和SRV9對鼬獾具有良好的免疫效果，免疫3周后有效抗體陽轉(zhuǎn)率分別為85％和80

12、％，說明兩種疫苗株均可作為鼬獾口服免疫的候選株。
　　論文創(chuàng)新點:
　　1.本研究首次對我國野生動物鼬獾狂犬病進行系統(tǒng)的流行病學監(jiān)測與分析，揭示了我國鼬獾狂犬病流行特征以及鼬獾源分離株與犬源和人源狂犬病流行株的演化關(guān)系。
　　2.首次發(fā)現(xiàn)不同演化分枝鼬獾RABV流行株存在毒力相關(guān)基因和演化相關(guān)基因的重要突變，明確狂犬病病毒在鼬獾中適應(yīng)的分子基礎(chǔ)。
　　3.首次完成了鼬獾的狂犬病口服免疫試驗，明確了我國現(xiàn)有疫苗株對