蒙古冰草抗旱相關(guān)基因克隆、表達(dá)及RNAi載體構(gòu)建.pdf

1、蒙古冰草（Agropyron mongolicum Keng）是我國荒漠草原和典型草原優(yōu)良的禾本科牧草，具有抗旱、抗寒、耐鹽堿、耐瘠薄、抗病蟲等優(yōu)異特性，是牧草和農(nóng)作物抗性改良的重要基因資源。同時，蒙古冰草是冰草屬中珍貴的二倍體物種，不僅具有較高的飼用價值，還具有重要的生態(tài)價值和遺傳育種價值。我國擁有豐富的蒙古冰草種質(zhì)資源，開展蒙古冰草抗逆性基因資源的挖掘和利用，對于我國蒙古冰草種質(zhì)資源的保護(hù)和種質(zhì)創(chuàng)新具有重要意義。本研究以蒙古冰草為材

2、料，開展了以抗旱基因為主的受逆境脅迫表達(dá)基因的克隆及其抗逆分子機(jī)制研究，主要結(jié)果如下： 1.采用PCR和RACE技術(shù)，從蒙古冰草中克隆了1個第四組LEA基因，命名為MwLEA。該基因cDNA全長961bp，編碼171個氨基酸。具有LEA—4超基因家族N端特征結(jié)構(gòu)域，C端序列不具備保守性，二級結(jié)構(gòu)中α—螺旋占主導(dǎo)，該基因前140個氨基酸的親水性較強(qiáng)，尾部序列親水性減弱，受干旱脅迫誘導(dǎo)表達(dá)。 2.采用RT—PCR技術(shù)，從蒙古冰草中克隆了1個

3、第三組LEA基因家族成員，命名為MwLEA3，基因全長1004bp，包含3個內(nèi)含子區(qū)和3個外顯子區(qū)，編碼189個氨基酸。具有8個重復(fù)的11aa—基元序列，氨基酸組成中丙氨酸、賴氨酸和蘇氨酸三種氨基酸約占總量的50％，不含半胱氨酸和色氨酸。二級結(jié)構(gòu)中α—螺旋占主導(dǎo)，親水性較強(qiáng)，經(jīng)Southern雜交分析，認(rèn)為該基因在基因組中以基因家族形式存在。 3.采用RT—PCR方法對MwLEA3基因的表達(dá)模式分析顯示，該基因在根莖中的表達(dá)量高于葉片中

4、的表達(dá)量；受干旱、高鹽、外源激素ABA的誘導(dǎo)，在植物體內(nèi)高水平表達(dá)。不同誘導(dǎo)條件下的基因表達(dá)模式存在差異。為深入研究MwLEA3基因的功能，以MwLEA3基因為靶標(biāo)構(gòu)建了RNAi表達(dá)載體pRNAiMwLEA3。 4.采用RT—PCR方法從蒙古冰草中克隆到肌動蛋白（Actin）基因，命名為MwACT。在誘導(dǎo)表達(dá)分析中，MwACT不受外界因素誘導(dǎo)表達(dá)量恒定，是組成型表達(dá)的管家基因。為研究其他基因在蒙古冰草中表達(dá)提供內(nèi)標(biāo)參照。 5.從蒙古冰草

5、中克隆到谷胱甘肽—S—轉(zhuǎn)移酶（GSTs）類基因，命名為MwGSTs，該基因具有GSTs超基因家族保守結(jié)構(gòu)域（C—terminal alpha helical domain）。二級結(jié)構(gòu)和親疏水性分析表明，MwGSTs基因具有結(jié)合疏水底物的H位點和較強(qiáng)的疏水特性。 6.本研究克隆的4個基因均與小麥同類基因高度同源，從遺傳進(jìn)化方面闡明了蒙古冰草進(jìn)化程度與小麥接近。從理論上支持了蒙古冰草是小麥野生近緣種這一觀點，從而確定蒙古冰草為小麥抗性改良基