白樺OSC新基因的克隆、RNAi載體構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化初步研究.pdf

1、白樺三萜類成分白樺脂醇、白樺脂酸及其衍生物在抗HIV病毒和抑制腫瘤方面具有顯著的療效。白樺各種三萜成分（白樺脂醇、齊墩果酸、達(dá)瑪烯二醇、固醇等）是以乙酰輔酶A原料經(jīng)甲羥戊酸途徑(MVA)在細(xì)胞質(zhì)中合成，均來自共同的前體物質(zhì)2，3-氧化角鯊烯，在不同三萜合酶基因(LUS、CAS、β-AS、DS)的調(diào)控下，沿著各自的代謝方向進(jìn)行生物合成，這就導(dǎo)致幾種產(chǎn)物之間產(chǎn)生競爭同一前體，并相互抑制合成。本研究利用同源序列PCR方法克隆獲得白樺OSC—香

2、樹脂醇合酶新基因，暫命名BpDS，并完成生物信息學(xué)分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建，同時(shí)進(jìn)行BpDS單基因及BpDS與CAS雙基因RNAi載體的構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化，以期通過基因工程手段阻斷白樺三萜分支途徑及促進(jìn)目標(biāo)產(chǎn)物白樺酯醇和白樺脂酸的合成與積累。
　　本研究結(jié)果如下：
　　1.以中國東北白樺（Betula Platyphlla suk）組培苗cDNA為模版，通過同源序列RT-PCR方法進(jìn)行白樺OSC基因克隆，利用生物信息軟件對(duì)該序列進(jìn)行

3、分子特征、理化性質(zhì)、同源性及系統(tǒng)樹進(jìn)化分析，結(jié)果顯示，獲得一個(gè)序列長度2636bp OSC基因，與日本白樺的一功能未知的OSC基因BPD相似度較高，為92％，與人參、遼東楤木、梅花等多種植物的Beta-香樹脂醇合成酶(β-AS)氨基酸序列具有66％～71％的相似性，推測(cè)可能為編碼香樹脂醇合成酶的一個(gè)白樺新OSC基因，暫命名為BpDS。通過生物信息學(xué)分析顯示，該基因開放讀碼框(ORF)序列長2211bp，編碼736個(gè)氨基酸，第98～725

4、 aa位置具有一個(gè)Isoprenoid_C2_like超家族，包含鯊烯環(huán)化酶結(jié)構(gòu)域(SQCY_1)保守區(qū)和一個(gè)異戊烯轉(zhuǎn)移酶和鯊烯氧化酶的重復(fù)序列，編碼的蛋白為不穩(wěn)定蛋白，具有親水性。運(yùn)用Blast2go分析結(jié)果顯示，該蛋白參與五環(huán)三萜類化合物的生物合成，包括有機(jī)環(huán)狀化合物代謝過程、三萜類化合物的生物合成過程、五環(huán)三萜類化合物代謝過程三大類生物合成途徑，同時(shí)具有角鯊烯合成酶活性、分子內(nèi)轉(zhuǎn)移酶活性、異構(gòu)酶活性催化活性。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示Bp

5、DS編碼的氨基酸序列同日本白樺OSCBPD(BAB83089.1)親緣關(guān)系最近，而與其他物種的beta-香樹脂醇合成酶的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。
　　2.以一年生白樺為試材，通過熒光定量PCR方法對(duì)BpDS基因表達(dá)特性進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，在生長季節(jié)（5月中旬～9月中旬），白樺葉中BpDS基因表達(dá)量在5月最低，9月與7月BpDS基因的表達(dá)量分別是5月表達(dá)量的31.5倍和26.7倍，白樺葉中6月和8月BpDS基因的表達(dá)量是5月的3.8倍和4.4

6、倍。白樺叢生苗BpDS基因的表達(dá)量在10μmol/L的ABA誘導(dǎo)1-72h后均有不同程度的上調(diào)，誘導(dǎo)處理12h～24h表達(dá)出現(xiàn)峰值。5mmol/L的乙烯誘導(dǎo)后僅在12h上調(diào)表達(dá)，表達(dá)量是對(duì)照的5.4倍，其余處理時(shí)間BpDS基因表達(dá)均被抑制，處理后1h表達(dá)量僅為對(duì)照的8％。白樺組培苗的根、莖和葉中BpDS基因的相對(duì)表達(dá)量結(jié)果顯示，莖中BpDS基因表達(dá)量最低，根和葉中BpDS基因表達(dá)量分別是莖中BpDS基因表達(dá)量的4倍和3.5倍。表明，白樺

7、BpDS基因的表達(dá)受季節(jié)、激素誘導(dǎo)調(diào)控，并具有組織特異性。
　　3.根據(jù)BpDS基因全長序列，以RNAi使用要求和pRNAi載體的要求為原則選取320bp BpDS基因片段序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，通過傳統(tǒng)的“酶切-連接”方法構(gòu)建了BpDSRNA干擾載體pBI1303-BpDS，通過三親雜交方法將pBI1303-BpDS導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404;同時(shí)利用pRNAi-GG載體，成功構(gòu)建雙基因干擾載體pRNAi-GG-BpDS-CAS，通過三

8、親雜交法獲得pRNAi-GG-BpDS-CAS農(nóng)桿菌工程菌株，為白樺三萜遺傳途徑改造研究奠定了基礎(chǔ)。
　　4.將成功構(gòu)建的白樺pBI1303-BpDS RNAi載體，通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤轉(zhuǎn)化法遺傳轉(zhuǎn)化白樺無性系，初步篩選抗性植株20株，經(jīng)PCR（NptⅡ、GUS基因）、Southern印跡鑒定和GPF熒光檢測(cè)，確定獲得4株轉(zhuǎn)基因白樺組培苗。同時(shí)對(duì)獲得的4株轉(zhuǎn)基因白樺苗。通過對(duì)轉(zhuǎn)基因白樺實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因株系