牛HSF1基因的遺傳變異及其與乳腺健康的相關(guān)性分析.pdf

1、熱休克轉(zhuǎn)錄因子1(Heat Shock Factor(1)，HSF1)是熱休克蛋白幾種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子(HSF1-4)中最重要的一個調(diào)控蛋白轉(zhuǎn)錄的基因。外界因素如溫差、毒素和炎癥都可激活HSF1基因調(diào)控蛋白的轉(zhuǎn)錄過程。本研究主要通過生物信息學(xué)、分子標(biāo)記和熒光載體共轉(zhuǎn)染細(xì)胞的方式，對HSF1基因的多態(tài)性以及其與奶牛生產(chǎn)性狀的關(guān)系、mRNA剪接體和microRNA-484(miRNA484)靶標(biāo)SNP進(jìn)行研究，為奶牛健康生產(chǎn)提供基礎(chǔ)的理論研究。

2、
　　 1.牛HSF1多態(tài)性以及mRNA剪接體的發(fā)現(xiàn)
　　 根據(jù)NCBI上已公布的HSF1的mRNA序列對其開放閱讀框(ORF)設(shè)計(jì)引物，以牛組織提取的RNA為模板，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物并進(jìn)行測序。對已發(fā)現(xiàn)的cSNP位點(diǎn)與HSF1的DNA全序列對比找出相應(yīng)的DNA的SNP位點(diǎn)，提取785頭中國荷斯坦奶牛血樣DNA，并采用PCR-RFLP和DNA測序等方法進(jìn)行多態(tài)性分析。擴(kuò)增出的ORF連接pEASY-T3載體，克

3、隆測序研究其mRNA剪切模式的多樣性。結(jié)果發(fā)現(xiàn):(1)存在突變位點(diǎn)m1387C＞T，經(jīng)過蛋白預(yù)測未引起氨基酸序列的改變;其中CC基因型407頭牛，CT基因型156頭牛和TT基因型222頭牛，符合Hardy-Weinberg平衡;(2) HSF1的mRNA存在多種不同形式的剪切體HSF1、HSF1a和HSF1b，其中HSF1b在退化的乳腺組織中的表達(dá)量極顯著。對不同患乳腺炎的乳腺組織的表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，在發(fā)生乳腺炎的乳腺組織中未發(fā)現(xiàn)HSF1a

4、，從而初步確定HSF1a和乳腺炎的關(guān)系。
　　 2.HSF1多態(tài)性與奶牛生產(chǎn)性能的關(guān)系
　　 測定研究奶牛群體的生產(chǎn)性能數(shù)據(jù)(DHI數(shù)據(jù))，包括產(chǎn)奶量，乳蛋白率，乳脂率和體細(xì)胞數(shù)評分(SCS)等。將奶?；蛐团c對應(yīng)的DHI數(shù)據(jù)整理，建立數(shù)學(xué)模型，利用SAS軟件對其進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。結(jié)果表明:TT基因型個體的SCS極顯著地高于基因CT型個體和CC型基因型個體(P＜0.01)。進(jìn)一步熒光定量PCR(qRT-PCR)對不同基因型的

5、乳腺組織的RNA進(jìn)行了定量分析。結(jié)果顯示:TT基因型個體乳腺組織的mRNA表達(dá)量極顯著低于CC基因型個體(P＜0.01)。
　　 3.MicroRNA-484靶標(biāo)SNP的研究
　　 通過預(yù)測得出microRNA-484與奶牛的HSF1基因的3'UTR區(qū)結(jié)合。此區(qū)域內(nèi)的SNP可能導(dǎo)致microRNA脫靶。本試驗(yàn)中，通過構(gòu)建結(jié)合區(qū)域SNP兩種不同型(G型和T型)的雙熒光載體和microRNA-484的CMV載體，在293T細(xì)