一株高致病性雞傳染性貧血病毒的生物學(xué)及基因組特性.pdf

1、雞傳染性貧血病毒(Chicken anernia virus，CAV)在世界主要養(yǎng)禽國家廣泛分布，是危害養(yǎng)禽業(yè)的主要病原體之一。CAV感染可以破壞造血系統(tǒng)，并可使淋巴器官萎縮，導(dǎo)致雞群免疫抑制，這又經(jīng)常使感染雞群并發(fā)或繼發(fā)其它病原體的多重感染，導(dǎo)致巨大經(jīng)濟損失。因此對CAV的系統(tǒng)研究甚為重要，本研究是從CAV的檢測方法、流行情況以及流行毒株的基因變異和致病性進(jìn)行系統(tǒng)的研究。 根據(jù)GenBank中已經(jīng)發(fā)表的CAV VP1基因的序列

2、，設(shè)計合成一對引物，利用PCR技術(shù)擴增CAV VP1基因的的核酸片段，利用非放射性標(biāo)記物地高辛(DIG)，通過PCR方法制備了CAV核酸探針。通過斑點雜交檢測方法對此探針特異性及靈敏度進(jìn)行驗證，特異性檢測結(jié)果表明，該探針能與標(biāo)準(zhǔn)模式株CAV核酸發(fā)生特異性雜交，而與對照的SPF雞、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒(REV)、馬立克氏病病毒(MDV)、呼腸孤病毒(REOV)核酸雜交反應(yīng)為陰性，具有較強的特異性。敏感性檢測結(jié)果表明，該探針對CAV的最

3、低檢出量為1 pg核酸，具有較高的靈敏度，顯示所制備的核酸探針用于臨床病料組織DNA中CAV感染的檢測是可行的。 本實驗收集山東泰安、臨沂、萊蕪、煙臺等8市3個品系、不同日齡發(fā)病雞群的384只病、死雞的脾臟樣品，其中麻雞105份、肉雞185份、蛋雞94份，通過斑點雜交方法檢測樣品中的CAV核酸，檢測結(jié)果為，CAV總檢出率為27.9％(107/384)。3個品系的雞的檢測結(jié)果：麻雞樣品的檢出率為37.1％(39/105)；肉雞樣品

4、的檢出率為31.3％(58/185)；蛋雞樣品的檢出率11.7％(11/94)。結(jié)果顯示，麻雞和肉雞中CAV感染的檢出率顯著高于蛋雞。3個不同日齡段的檢測結(jié)果：1-20日齡的樣品檢出率為6.4％(7/110)；20-60日齡的樣品檢出率為45.6％(93～04)；60日齡以上的樣品檢出率為10.0％(7/70)。結(jié)果顯示，20-60日齡的檢出率顯著高于1-20日齡和60日齡以上的，而20-60日齡段是疾病的高發(fā)階段。 其中，從自

5、山東某商品代肉雞場20日齡病雞群表現(xiàn)生長遲緩，疑似雞傳染性貧血病病毒(CAV)感染的脾臟、胸腺、骨髓樣品提取DNA，分別經(jīng)斑點雜交檢測為CAV陽性后，其余病料研磨上清經(jīng)處理后接種7日齡SPF雞胚和1日齡SPF雞，提取接種后的雞胚和SPF雞的脾臟組織DNA，經(jīng)斑點雜交驗證為陽性，從而成功分離到了一株雞傳染性貧血病毒野毒株，命名為CAV-SDLX08株。用PCR方法分段擴增出CAV-SDLY08基因組的三條部分重疊片段，分別克隆于T載體并進(jìn)

6、行測序，拼接后得到其全基因組序列。結(jié)果表明，SDLY08株基因組全長2298nt，含有三個互相重疊的開放閱讀框和一個調(diào)控區(qū)。將SDLY08全基因與已發(fā)表的8個CAV分離株基因組比較，同源性為96.6％-99.0％。CAV的三個編碼基因VP1、VP2和VP3所編碼的氨基酸均有一定程度變異，以VP1基因編碼的氨基酸變異性最大，同源性為96.9％-99.0％ 將CAV-SDLY08株接種感染1、7、21日齡SPF雞，研究其致病性。通過

7、口服和肌肉注射兩種途徑分別感染1、7、21日齡SPF雞，12天后對每組SPF雞體重、免疫器官指數(shù)和血液指標(biāo)進(jìn)行測定。 體重增重方面：感染12天后，1、7日齡感染組的體重顯著低于對照組(P<0.05)，而兩不同途徑感染組間的差異不顯著(P>0.05)。21日齡感染組體增重也低于對照組，但差異不顯著(P>0.05)，兩種感染方式的差異也不顯著。 免疫器官指數(shù)方面：感染12天后，不同日齡的感染均能引起脾臟的腫大，1日齡感染的口

8、服組和注射組與對照組比差異顯著(P<0.05)。7日齡和21日齡的與對照組比，差異不顯著(P>0.05)，且感染途徑影響不大。3個日齡感染都能引起胸腺的顯著萎縮，且不同的感染日齡和感染方式的實驗組與對照組相比差異都極顯著(P<0.01)。 血液指標(biāo)方面：感染12天后，可引起白細(xì)胞數(shù)量的減少，1日齡感染的口服組和注射組與對照比差異極顯著(P<0.01)。7日齡和21日齡，注射組顯著低于口服組和對照組(P<0.05)，口服組和對照組

9、差異不顯著(P>0.05)。與對照組相比，CAV感染都能引起紅細(xì)胞數(shù)量的顯著減少(P<0.01)，口服組和注射組與對照組相比差異極顯著(P<0.01)，且兩種感染方式之間差異顯著(P<0.05)。與對照組相比，都能引起紅細(xì)胞壓積的顯著減少(P<0.01)，1日齡和7日齡感染的口服組和注射組差異極顯著(P<0.01)，21日齡差異顯著(P<0.05)。 綜合結(jié)果顯示，CAV-SDLY08株感染三個日齡SPF雞12天后，均可導(dǎo)致增重