奶山羊乳腺消減文庫(kù)構(gòu)建及差異表達(dá)基因的研究.pdf

1、乳腺為哺乳動(dòng)物新生兒的生長(zhǎng)發(fā)育提供營(yíng)養(yǎng)均衡的乳汁，并且可以為人類生活提供不可缺少的乳制品。在奶山羊的生理周期中乳腺組織經(jīng)歷發(fā)育、泌乳和退化三個(gè)循環(huán)過程，與此同時(shí)乳腺上皮細(xì)胞也歷經(jīng)增殖、分化，凋亡的變化。在奶山羊一個(gè)泌乳周期的不同階段，產(chǎn)奶量的高低和乳成分的變化存在很大的差異，隨著基因組學(xué)研究的不斷深入，人們逐漸認(rèn)識(shí)到導(dǎo)致這些差異產(chǎn)生的原因，是由乳腺組織中諸多相關(guān)功能基因時(shí)空表達(dá)決定的，即在不同泌乳期乳腺組織中的功能基因差異表達(dá)的結(jié)果。本

2、研究在西農(nóng)薩能奶山羊泌乳生理變化規(guī)律的基礎(chǔ)上，構(gòu)建不同泌乳期乳腺差異表達(dá)基因文庫(kù)，克隆篩選到的差異表達(dá)基因，進(jìn)行生物信息學(xué)分析和預(yù)測(cè)，采用實(shí)時(shí)定量PCR分析其表達(dá)模式，并對(duì)可能影響乳成分變化的重要候選基因骨橋蛋白（OPN）進(jìn)行初步的探討。為進(jìn)一步研究奶山羊乳腺泌乳的分子機(jī)制，以及產(chǎn)奶量和乳成分調(diào)控機(jī)理提供理論依據(jù)。 1、利用抑制性消減雜交（SSH）技術(shù)構(gòu)建西農(nóng)薩能奶山羊泌乳初期和盛期乳腺組織正反（E-P和P-E）向差減cDNA文

3、庫(kù)，以管家基因GAPDH作為消減指標(biāo)檢測(cè)兩個(gè)文庫(kù)的消減效率分別為25和210倍，表明了泌乳初期和盛期乳腺組織中差異表達(dá)基因的富集效率也達(dá)到25倍以上；對(duì)E-P和P-E消減文庫(kù)中部分差異表達(dá)基因進(jìn)行測(cè)序，E-P文庫(kù)測(cè)序分析后得到的差異表達(dá)基因按功能可大致分為：乳蛋白形成的相關(guān)基因（aS2酪蛋白、β酪蛋白、κ酪蛋白、a乳白蛋白前體物），轉(zhuǎn)錄復(fù)合體相關(guān)基因（核糖體蛋白L10、核糖體蛋白L23、核糖體蛋白3B、Cbp/p300），能量代謝相關(guān)基

4、因（NADH脫氫酶），細(xì)胞增殖分化相關(guān)基因（GHITM、OPN和H3F3B）：P-E文庫(kù)中差異表達(dá)基因可分為：脂肪代謝相關(guān)基因（HFABP、PPARGC1A），細(xì)胞生長(zhǎng)代謝相關(guān)基因（SAA3、SSAT、SPARC和LPO），轉(zhuǎn)錄相關(guān)基因（剪接因子3B）；將奶山羊基因組中尚未克隆和研究的新基因PPARGC1A、OPN、SPARC、GHITM和SSAT采用實(shí)時(shí)定量PCR進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果E-P文庫(kù)中OPN、GHITM在泌乳初期乳腺組織中mRNA

5、的表達(dá)豐度分別比泌乳盛期高5.04和4.20倍，P-E文庫(kù)中PPARGC1A、SPARC、SSAT在泌乳盛期乳腺組織中mRNA的表達(dá)豐度分別比泌乳初期高3.58、12.13和8.0倍，均為陽(yáng)性克隆。 2、根據(jù)不同物種間相同基因編碼區(qū)的保守性和同源性序列設(shè)計(jì)合成引物，采用RT-PCR技術(shù)克隆了奶山羊乳腺中PPARGC1A、OPN、SPARC、GHITM和SSAT基因的編碼區(qū)序列，并提交Genbank獲得登錄號(hào)；利用在線多個(gè)生物信息

6、學(xué)分析軟件對(duì)山羊、牛、人和小鼠的PPARGC1A、OPN、SPARC，GHITM和SSAT基因編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能預(yù)測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)五個(gè)基因在不同物種間氨基酸序列高度同源，所編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、跨膜螺旋、信號(hào)肽和潛在功能位點(diǎn)大致相同。其中PPARGC1A是一種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，各物種均預(yù)測(cè)含有N端的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)、核激素相互作用的LXXLL基序及C端的RNA識(shí)別基序；OPN是親水性的分泌型糖蛋白，在不同的物種OPN均普遍存在RGD基序，該基序與

7、細(xì)胞聚集、黏附、增殖及組織重塑等有關(guān)，山羊OPN比人和小鼠多cAMP依賴的蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)，凝集因子VLSPR重復(fù)位點(diǎn)；SPARC是一種小分子的糖蛋白，結(jié)構(gòu)域N端274-286處含有EF-hand鈣結(jié)合位點(diǎn)，可能與乳腺中鈣的代謝有關(guān)；GHITM是一種跨膜蛋白，有8個(gè)強(qiáng)跨膜區(qū)域，推測(cè)該基因可能與乳成分的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)；SSAT是細(xì)胞內(nèi)維持代謝平衡的關(guān)鍵酶，有1個(gè)Gcn5-乙酰胺基轉(zhuǎn)移酶功能域與SSAT的催化作用密切相關(guān)。 3、以β

8、-actin為內(nèi)標(biāo)，采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)測(cè)定西農(nóng)薩能奶山羊在一個(gè)泌乳周期（泌乳初期、盛期、中期、后期、末期和干奶期）中PPARGC1A、OPN、SPARC、GHITM和，SSAT基因的表達(dá)豐度變化規(guī)律，結(jié)果表明：PPARGC1A和SSAT基因的變化趨勢(shì)與泌乳曲線基本一致，推測(cè)它們是乳腺泌乳周期性變化的調(diào)節(jié)因子；OPN在泌乳初期的表達(dá)豐度相對(duì)值最高，依次是泌乳后期、末期、盛期、中期和干奶期，其中泌乳初期相對(duì)表達(dá)水平約為末期高3.9倍左右

9、，進(jìn)一步說明，在妊娠后期OPN基因就開始表達(dá)，OPN基因可能在乳成分變化中發(fā)揮重要的生理功能；SPARC在泌乳初期的表達(dá)豐度相對(duì)值最高，隨后一直下降，在干奶期表達(dá)量最低；GHITM在泌乳初期的表達(dá)豐度相對(duì)值最高，依次是泌乳后期、盛期、末期和干奶期表達(dá)量最低。 4、構(gòu)建OPN基因真核表達(dá)重組質(zhì)粒pcDNA3.1/myc-His（-）A-OPN，與空質(zhì)粒同時(shí)轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞，利用MTT試驗(yàn)檢測(cè)OPN基因?qū)CF-7細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，